עריכת גנום ביתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti באמצעות CRISPR-Cas9

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לעריכת גנום באמצעות מיקרו-הזרקה עוברית ביתוש A. aegypti באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9.

היקף המחקר שלנו כולל הקמת קווי יתושים מהונדסים גנטית באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9. השימוש בטכנולוגיית CRISPR-Cas9 לדיכוי אוכלוסיית יתושים, PgSIT, כמו גם להקמת מערכות ביטוי בינאריות לבקרה זמנית מרחבית של ביטוי גנים.

השגנו גם קווי נוקאאוט וגם קווי נוק-אין באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9. קווי הנוקין שלנו כוללים החדרת טרנס-אקטיבטור QF המאפשר בקרה זמנית מרחבית של גנים במורד הזרם, כגון סמנים פלואורסצנטיים, GFP, לתיוג ספציפי לרקמות ומדווחים על פעילות עצבית, G-CaMP6.

הקמת קווים מוטנטיים חדשים של יתושים תאפשר הבנה מעמיקה יותר של תפקוד הגנים והשלכות עצביות, פיזיולוגיות והתנהגותיות. זה עשוי להוביל לפיתוח דרכים חדשות למניעת העברת מחלות המועברות על ידי יתושים. המעבדה שלנו פיתחה טכנולוגיה לדיכוי אוכלוסיית יתושים המסתמכת על טכנולוגיית CRISPR-Cas9 כדי להפיל גנים הקשורים לפוריות הגבר ויכולת הקיום הנשי. כמו כן, הקמנו מספר קווי יתושים לחקר עמידות חושית ליתושים, במיוחד חוש הריח והראייה.

[מראיין] כדי להכין את מבנה ההזרקה למוטציות נוקאאוט, יש לדלל את חלבון Cas9 לריכוז הרצוי באמצעות מאגר הדילול Cas9. לאחר מכן יש לדלל את ה-aliquot של RNA מנחה מסונתז במבחנה או gRNA במים טהורים במיוחד. מערבבים מראש את חלבון Cas9 המדולל עם כל gRNA ליצירת קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין. לאחר מכן שלב את התמיסות המרובות של קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין מעורבב מראש. להחדרת קלטות גנים בתיווך תיקון מכוון הומולוגיה, יש לדלל ולערבב את חלבון Cas9 ו-gRNAs. מדללים את הפלסמיד התורם במים טהורים במיוחד ומשלבים את כל המבנים. לאחר מכן, השתמש בחוט קוורץ כדי להכין את מחטי המיקרו-הזרקה. באמצעות התוכנית הבאה. משוך את המחטים בעזרת חולץ מיקרופיפטה בלייזר. לאחר הגדרת שואב ידני, הרטיבו ניירות סינון עיגולים לבנים והניחו אותם על הקיר הפנימי או על גבי כותנה לחה בתוך הקולט. הכניסו חמש עד 10 נקבות יתושים שהוזנו בדם לפני חמישה עד 10 ימים לתוך הקולט. לאחר מכן הניחו את הקולט בחושך למשך 45 דקות. לאחר מכן, הסר את היתושים מהאספן. לאחר הדגירה, הסר את ניירות הסינון כדי לקצור את העוברים. בחר עוברים בשלב קדם-בלסטודרם בצבע אפור בהיר מנייר הקציר. העבירו את העוברים שנבחרו בעזרת מברשת רטובה לסרט דביק דו צדדי המונח על גבי תלוש כיסוי. יישר את העוברים במקביל, וודא שהם זה לצד זה כאשר כל הקצוות האחוריים פונים לחזית בעוד שסביבתם נשארת רטובה. במהלך היישור, הוסף שמן Halocarbon 700 על העוברים כדי למנוע התייבשות. על המיקרו-מזרק, הגדר לחץ פיצוי של 300 הקטופסקל ולחץ הזרקה של 500 הקטופסקאל. בעזרת מעמיס מיקרו, טען שלושה מיקרוליטר ממבנה ההזרקה לתוך מחט. הנח את פתק הכיסוי עם עוברים מיושרים על שקופית מיקרוסקופ ומקם אותו מתחת למיקרוסקופ להזרקה. לאחר מכן, אבטח מחט לתוך מחזיק המחט בעזרת מיקרו-מניפולטור בזווית של 10 מעלות לכיוון הקצה האחורי של העוברים. פתח את המחט בעדינות על ידי נגיעה קלה בקצה שלה בקצה החלקת הכיסוי. לאחר מכן הזריק לעובר את מבנה הפלסמיד. לאחר הזרקת יתושי Aedes agyptie עם מבנה הזרקה, השתמש במגבונים חד פעמיים נטולי מוך כדי להסיר את השמן המקיף את העוברים. הוסף מים נטולי יונים כדי לשטוף את העוברים. העבירו את העוברים השטופים על נייר סינון רטוב והניחו את נייר הסינון על טישו רטוב בתוך של תשעה אונקיות קאראט. לאחר מכן הניחו כותנה רטובה בתחתית הכוס כדי לשמור על לחות. לאחר שמירה על לחות העוברים במשך שלושה עד ארבעה ימים, העבירו את נייר הסינון עם העוברים לכשלושה ליטר מים נטולי יונים במחבת סטריליט של שישה ליטרים לבקיעה. לאחר שזחלי ה-G zero בוקעים, הוסיפו למחבת מזון דגים מעורבב במים. סנן את זחלי ה-G zero עבור הסמן הפלואורסצנטי בשלב הזחל השלישי עד הרביעי. הפרד את הזחלים על סמך מצבם הפלואורסצנטי. שמור על זחלים חיוביים פלואורסצנטיים ושליליים פלואורסצנטיים במחבתות נפרדות. הפרד את היתושים המוזרקים לפי מין כשהם גולמים וזהה זכרים לפי גודלם הקטן יותר, אונת איברי המין הבולטת והמחודדת יותר והמשוטים הרחבים יותר. זהה נקבות לפי גודלן הגדול יותר, אונת איברי המין הפחות בולטת והמשוטים הצרים יותר. לאחר איגום יתושים חיוביים פלואורסצנטיים או שליליים פלואורסצנטיים מכל מין, הכלאו כל בריכה עם יתושים מהמין השני מזן ליברפול A. agyptie מהסוג הפראי ביחס של שלושה עד חמישה פרטים מסוג בר לכל פרט שנבדק פלואורסצנטי, מה שמאפשר להם להזדווג במשך ארבעה ימים. לאחר שלושה עד ארבעה ימים, סנן את זחלי G1 עבור הסמן הפלואורסצנטי בשלבי הזחל השלישי עד הרביעי.