מבחני פלואורסצנטיות לחקר אינטראקציה של Mycobacterium tuberculosis עם הקולטן החיסוני SLAMF1

המחקר שלנו מספק מדריך שימושי לחקר האינטראקציה הביוכימית בין מיקרובקטריום טוברקולוזיס וחיישנים מיקרוביאליים המבטאים מיקרופאג'ים אנושיים, ויהיה רלוונטי למולקולות הנוקשות יותר הממלאות תפקיד בכניסת מיקרובקטריום טוברקולוזיס לפיברוציטים. אינטראקציה עם קולטנים נחקרה לאורך השנים באמצעות גישות המשתמשות בדרך כלל במכונות מדווח, מולקולות הרמטיות, חלבונים רקומביננטיים מפולסים, מודלים של נוק-אאוט, נוקדאון, ביטוי נמוך יותר. טכניקות אלו יכולות להיות מאתגרות, תובעניות זמן ולפעמים יקרות.

באמצעות הפרוטוקול שפורסם, אנו מראים לראשונה כי במקרופאגים, קולטן SLMF1 מקיים אינטראקציה עם מיקובקטריום טוברקולוזיס, מקדם ספיגת חיידקים ומוביל להתבגרות אנדוליזוזומלית. התגברנו על קשיים הקשורים לניסויים בביטוי גנים ותיארנו יעד חדש לאסטרטגיות טיפוליות חדשות. הפרוטוקול שלנו מציע שתי חלופות לאיתור אינטראקציה ביוכימית בין מיקרובקטריום טוברקולוזיס לחיישן מיקרוביאלי SLMF1 באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית, שתי טכניקות זמינות בדרך כלל ונמצאות בשימוש פורה.

למתודולוגיה זו שימושים פוטנציאליים רבים וניתן להתאים אותה בקלות בהקשרי מחקר אחרים. אנו מספקים פרוטוקול פשוט המעריך אינטראקציה עם קולטן מיקובקטריום טוברקולוזיס באמצעות חיידקים מומתים וקוליים של תאים שלמים, שניתן לבצע בתנאי BSL2, אך מותאם בקלות לקולטנים אחרים ולזנים חיים. במידת הצורך, ניתן לבצע בדיקות אלה גם בתנאי BSL3 עם פתוגנים חיים שונים.

כדי להתחיל, העבירו בזהירות את הדם שנאסף מתורמים בריאים לצינורות של 50 מיליליטר ודללו אותו למחצית נפחו במי מלח. הכן מדיום שיפוע צפיפות וצנטריפוגה את הדגימה להפרדת תאים חד-גרעיניים בדם היקפי, PBMCs. אסוף את ה- PBMCs מההילה הלבנה.

לאחר ספירת התאים בתא ספירת תאים, בצע ברירה מגנטית עם חרוזי CD14 כדי לאסוף את המונוציטים החיוביים CD14. לאחר מכן השעו מחדש את התאים המבודדים במדיום RPMI 1640. זרע 500 מיקרוליטר של מונוציטים חיוביים CD14 בריכוז של 1 כפול 10 בחזקת שישה תאים למיליליטר לכל באר של צלחת תרבית תאים של 24 בארות בהיעדר סרום כדי לקדם היצמדות.

לאחר שעתיים, שטפו את הבארות במדיום RPMI 1640 מחומם מראש כדי להסיר תאים שאינם נדבקים. הבדיל את המונוציטים למקרופאגים באמצעות מיליליטר אחד של מדיום RPMI 1640 שלם למשך 16 עד 18 שעות. למחרת, שטפו את הבארות במיליליטר אחד של PBS והוסיפו מיליליטר אחד של מדיה שלמה RPMI 1640 לכל באר.

לעורר את המקרופאגים עם 10 מיקרוליטר של אנטיגנים של מיקובקטריום טוברקולוזיס סוניקציה למשך 24 שעות. למחרת, בעזרת פיפטה P-1000, השליכו את מדיום ה-RPMI השלם מבארות הצלחת. הוסיפו PBS קר ופיפטה למעלה ולמטה כדי לקצור את המקרופאגים.

העבירו את התאים לצינורות מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינורות ב-500G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה במאגר בדיקת משקעים רדיו-אימונוגרפיים משלימים.

דגרו את המתלה על קרח למשך שעה, מערבולת כל 10 דקות. צנטריפוגה את המתלה ב-14,000 גרם למשך 15 דקות ואוספים את הסופרנטנט. דגירה אחת כפול 10 בחזקת שישה תאי מיקובקטריום טוברקולוזיס מומתים שלמים עם 50 מיקרוליטר של תמצית חלבון מאחת כפול 10 לעוצמה של שישה מקרופאגים בן לילה בארבע מעלות צלזיוס במחזיק מיקרו צינור מסתובב.

למחרת, כדי לצבוע את קומפלקס חיידקי החלבון, הוסיפו את הנוגדן האנטי-אנושי SLAMF1 לצינור המיקרו, מערבלו את התערובת ודגרו למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בחושך. לאחר שטיפת קומפלקסי חיידקי החלבון עם FACS, השעו אותם מחדש במאגר FACS ורכשו את הדגימה על ציטומטר זרימה. בעזרת פינצטה כירורגית עם אף עגול, הנח החלקות כיסוי עגולות בגודל 12 מילימטר לבארות של צלחת תרבית 24 בארות.

דגרו על תלוש הכיסוי עם אנטיגנים Mycobacterium tuberculosis rhodamine למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה מוסיפים 100 מיקרוליטר תמצית חלבון מדוללת ב -300 מיקרוליטר PBS ודוגרים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם תסיסה. עטפו את מכסה צלחת התרבות בניילון פרפין.

הוסף טיפה של 60 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני אנטי SLAMF1 שצוין בעבר על המכסה המכוסה בסרט הפרפין. הסר בזהירות את החלקת הכיסוי מהצלחת באמצעות פינצטה ומחטים כירורגיות מעוקלות עם קצה עדין. לאחר הדגירה עם תמיסת נוגדנים ראשונית ומשנית, הסר עודפי נוזל והתקן את החלקת הכיסוי על טיפת נוזל הרכבה המונחת על מגלשת זכוכית.

הנח את השקופית מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי והתבונן בתאים באמצעות מסננים מתאימים. מונוציטים בודדו בהצלחה מ-PBMCs עם טוהר של 95% ומעלה, ומקרופאגים שמקורם במונוציטים נוצרו לאחר היצמדות ותרבית לילה. ביטוי פני השטח של SLAMF1 הושרה במקרופאגים שעוררו באנטיגנים של מיקובקטריום טוברקולוזיס, ורמותיו אושרו באמצעות ציטומטריית זרימה.

האינטראקציה בין SLAMF1 לתאים שלמים של מיקובקטריום טוברקולוזיס הודגמה באמצעות בדיקת קישור צולב ואחריה ציטומטריית זרימה. האינטראקציה בין האנטיגנים SLAMF1 ו-Mycobacterium tuberculosis הודגמה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית עם לוקליזציה משותפת שאושרה על ידי תמונות ממוזגות.