טיהור הרטיקולום הסרקו-אנדופלזמי Ca²⁺-ATPase משריר הארנב

המחקר שלנו מתמקד בטיהור SERCA, עם איכות מבנית גבוהה ופעילות קטליטית, תוך חקירה האם טרהלוז מייצב את SERCA במהלך הטיהור, ומשפר את היציבות והפונקציונליות שלו. קביעת המבנה התלת מימדי של ATPases מסוג P במצבם האוליגומרי. השימוש בבינה מלאכותית למודלים מבניים של ATPases, סימולציות דינמיקה מבנית ועגינה מולקולרית של ליגנדים כדי לחקור טיפולים במחלות ולשפר את ניתוח תפקודי החלבון וטכנולוגיות חדשות יותר. האתגרים הנוכחיים כוללים הבנת מנגנוני המרת אנרגיה ב-P-ATPases, הבהרת האופן שבו המבנה הרבעוני מווסת את התפקוד והפעילות, וזיהוי מעכבים יעילים ליישום טיפולי במחלות אנושיות. אנו מאשרים את המצב ההקסמרי של פרוטון-ATPase ממברנת פלזמה GS ומדגימים את תלות הדינמיקה המבנית או צמיגות המדיום כפי שמתואר בתיאוריה של קרמרס.

[קריין] כדי להתחיל, השג שריר עווית מהיר מ-Oryctolagus cuniculus מסוג בר. השעו אותו בשלושה כרכים של אשלגן כלורי 100 מילימולר להשריה. ערבבו במשך דקה אחת, ולאחר מכן דקה אחת של מנוחה קרה כקרח. צנטריפוגה של הדגימה ב-1,500 גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להסיר את שאריות הרקמות. אוספים את הסופרנטנט לתוך צינור, ואז הופכים אותו להומוגניזציה בעזרת מטחנת רקמות. לאחר מכן, צנטריפוגה את ההומוגנאט, ואחריה את הסופרנטנט. השעו את הכדורים בכ- 40 מיליליטר של סוכרוז מולארי 0.5. כעת, צנטריפוגה את המתלה ב-12,000 גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. יש לדלל את הסופרנטנט המתקבל ב-0.6 אשלגן כלורי מולארי ו-0.15 סוכרוז מולארי לפני הצנטריפוגה. השעו את הגלולה המכילה יריעות שלפוחית רשתית סרקופלזמית במאגר המכיל 0.3 סוכרוז מולרי, 0.1 אשלגן כלורי מולרי ו-5 מילי-מולרי טריס-הידרוכלוריד ב-pH 7.0. הציגו את שלפוחיות הרטיקולום הסרקופלזמיות בנפחים של 1 מיליליטר. דגרו את תרחיף שלפוחית הרטיקולום הסרקופלזמי על קרח למשך 10 דקות עם תסיסה עדינה, ואז צנטריפוגה. השעו את הגלולה בפחות מ-3 מיליליטר של מאגר טריס-הידרוכלוריד של 25 מילי-מולרי. לאחר הומוגניזציה של המתלה, התאם אותו לנפח סופי של 10 מיליליטר עם מאגר טריס-הידרוכלוריד. קבע את ריכוז החלבון באמצעות מבחן Lowry. הוסף אזולקטין ב -5 מיליגרם למיליליטר ולאחר מכן הוסף 0.85 Zwittergent 3-14. הומוגניזציה של המתלה שוב וצנטריפוגה ב -100,000 גרם ב -4 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. אסוף את הסופרנטנט בצינור חדש. יש לדלל אותו ביחס של 1 ל-2 עם EGTA של 2 מילי-מולרי ב-pH 7.2. יוצקים את התרחיף בעדינות על שיפוע ריכוז טרהלוז לא רציף במאגר Tris. ואז צנטריפוגה כמו קודם ואוספים את הגלולה השקופה והצהובה מעט. השעו את הגלולה בעדינות בנפח קטן של מאגר Tris. מדוד את ריכוז החלבון, ולאחר מכן דלל אותו כדי להתאים את ריכוז החלבון ל-2 מיליגרם למיליליטר. לפעילות ATPase, הכינו 1 מיליליטר מתערובת התגובה. מערבל את בדיקת התגובה להומוגניזציה, ואז דגר אותה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הוסף 0.9 יחידות של L-לקטט דהידרוגנאז ו-1.5 יחידות של פירובט קינאז. הוסף 10 מיקרוגרם של SERCA כדי להתחיל את תגובת ATPase. עקוב אחר שינוי הספיגה כל שנייה למשך 600 שניות במהירות של 340 ננומטר עם ספקטרופוטומטר בעל מחזיק תא תרמוסטטי כדי לקבוע את היווצרות NAD. לבדיקת התיוג של SERCA עם פלואורסצאין איזותיוציאנט, או FITC, השעו תחילה 20 מיקרוגרם של SERCA ב-50 מיקרוליטר של מאגר תיוג. מערבולת לערבב היטב. לאחר מכן דגרו את הדגימות בחושך בטמפרטורת החדר למשך 15, 10, 7, 5 ו -2 דקות. כדי לעצור את תגובת התיוג, הוסף נפח שווה של מאגר עצירה קר כקרח. דגירה על קרח בחושך למשך 5 דקות. כפוף את ה-SERCA שכותרתו FITC ל-SDS-PAGE. חשוף את הג'לים השקופים לאור אולטרה סגול באורך גל של 302 ננומטר וצלם את התוצאה. לבסוף, מכתימים את הג'ל בכחול Coomassie. תעד את התוצאה בפוטו. לניתוח ספקטרום דיכרואיזם מעגלי, השעו תחילה את SERCA ב-400 מיקרוליטר של מאגר פוספט 10 מילי-מולרי של pH 7.0 ב-25 מעלות צלזיוס. טען את הדגימה לתא באורך נתיב של 0.1 סנטימטרים. כעת, הגדר את טווח הספקטרום האולטרה סגול הרחוק בין 190 ל-260 ננומטר ואת הרזולוציה הפנימית ורוחב הפס ל-1 ננומטר. רשום את אות הדיכרואיזם המעגלי במהירות של 50 ננומטר לדקה ב-25 מעלות צלזיוס. ג'ל SDS-PAGE המוכתם בכחול של Coomassie הדגים את ההעשרה של רצועת החלבון SERCA עם התקדמות הטיהור. שלב הטיהור האחרון של SERCA באמצעות אולטרה-צנטריפוגה על שיפוע ריכוז טרהלוז הביא לטוהר העולה על 90%. שלפוחיות רשתית סרקופלזמית הכילו כמות גבוהה של SERCA, כאשר כ-73% מכלל החלבון בשלפוחיות תואם ל-P-ATPase זה. דפוס קינטי של מיכאליס-מנטן נצפה עבור ה-SERCA המטוהר בקצב ההידרוליזה של ATP לעומת עקומת ריכוז ה-ATP, המאשר את הפונקציונליות האנזימטית שלו. תרשים Lineweaver-Burk חשף קבוע מיכאליס של כ-10 מיקרומול עבור ATP, התואם את הערכים שדווחו בעבר. תיוג FITC של SERCA הצביע על אתר קשירת נוקלאוטידים שלם. להקת SERCA המוכתמת בכחול של Coomassie התאימה בדיוק ללהקה עם תווית FITC. ספקטרוסקופיה של דיכרואיזם מעגלי אישרה את האיכות המבנית הגבוהה של ה-SERCA המטוהר, כאשר הספקטרום שלו מצביע על אלמנטים של מבנה משני מוגדרים היטב.