Name: טיהור הרטיקולום הסרקו-אנדופלזמי Ca2+-ATPase משריר הארנב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: למדו שיטה משופרת לטיהור SERCA משריר ארנב באמצעות טרהלוז לייצוב חלבונים. השיטה מייצרת SERCA בטוהר של מעל 90% עם פעילות קטליטית גבוהה למחקרים מבניים ותפקודיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות בינלאומיות ומקומיות (NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999) לטיפול בבעלי חיים במעבדות ניסוי 51,67,68. רקמת שריר התקבלה מ-Oryctolagus cuniculus מסוג בר מיחידה מקומית לטיפול בבעלי חיים (INE/CITES/DGVS-ZOO-E0055-SLP-98)46. וטרינר עם מומחיות בניהול חיות מעבדה ביצע את הדיסקציה והעיבוד הראשוניים של השרירים. פרטי הריאגנטים והציוד המשמש במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.
1. בידוד של רשתית סרקופלזמית משריר ארנב מהיר (תזמון, 7 - 9 שעות)
הערה: לפרטים על ההליך, עיין ב-Champeil et al.69.
<ol>
	<li>השג רקמת שריר מהירה (~70 גרם משתי הרגליים האחוריות לכל חיה) מ-Oryctolagus cuniculus מסוג בר. הערה: נדרש זיהוי חזותי מוקדם של השרירים שיש לנתח70,71.</li>
	<li>השרו את שריר העוויתות המהיר בבלנדר על ידי תלייתו בשלושה נפחים של 100 מ"מ של KCl, עם דקה אחת ודקה אחת במנוחה קרה כקרח, חזור על הפעולה שלוש פעמים72.</li>
	<li>הסר את פסולת הרקמה על ידי צנטריפוגה (1500 × גרם) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; צנטריפוגה שנייה (4200 × גרם) מבוצעת במידת הצורך.</li>
	<li>אסוף את הסופרנטנט והומוגניזציה שלו באמצעות מטחנת רקמות (10 משיכות במהירות נמוכה, כלומר 500-1,500 סל"ד)72,73. צנטריפוגה את ההומוגנאט (10,000 × גרם) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. הערה: יש לנקוט בזהירות בעת הומוגניזציה, שכן שימוש במהירות גבוהה יחסית עלול לגרום לנזק למערכת ולמפעיל.</li>
	<li>צנטריפוגה הסופרנטנט (המכיל את הרטיקולום הסרקופלזמי) (33,000 × גרם) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 120 דקות.</li>
	<li>השעו את הכדורים ב-40 מ"ל של 0.5 מ' סוכרוז וצנטריפוגה (12,000 × גרם) ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. יש לדלל את הסופרנטנט (0.6 מ' KCl ו-0.15 מ' סוכרוז) ולצנטריפוגה את התרחיף (34,000 × גרם) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 165 דקות.</li>
	<li>השעו את הגלולה המכילה את יריעות שלפוחיות הרטיקולום הסרקופלזמיות (SRVs) ב-0.3 מ' סוכרוז, 0.1 מ' KCl ו-5 מ"מ של Tris-HCl, pH 7.0. קבע את ריכוז החלבון על ידי שימוש במבחן Lowry74 ובאלבומין בסרום אנושי כתקן החלבון.</li>
	<li>יש להשתמש ב-SRVs (30-32 מ"ג/מ"ל) בנפח של 1 מ"ל. אחסן את דגימות ה-SRVs ב-72 מעלות צלזיוס להמשך עיבוד. הערה: תפוקת החלבון היא 100-110 מ"ג SRV לבעל חיים.</li>
</ol>
2. טיהור SERCA (תזמון, 18 - 20 שעות)
הערה: לפרטים על ההליך, עיין ב-Rivera-Morán et al.46.
<ol>
	<li>יש לדלל את תרחיף ה-SRVs ל-2 מ"ג חלבון/מ"ל באמצעות 75 מ"מ קר כקרח של Tris-HCl, pH 7.2, 0.6 מ"מ של KCl, 6 מ"מ של EDTA, 1 מ"מ של EGTA ו-0.1% (w/v) דאוקסיכולאט (DOC). דגרו את מתלי ה-SRV על קרח למשך 10 דקות ותסיסה עדינה. צנטריפוגה מתלה ה-SRV (100,000 × גרם) ב-4 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. הערה: יש להוסיף DOC טיפה אחר טיפה.</li>
	<li>השעו את הכדורים ב-&lt;3 מ"ל של 25 מ"מ של Tris-HCl, pH 7.5, 0.3 מ' של KCl, 45% גליצרול (v/v) ו-2 מ"מ EDTA. הומוגניזציה של המתלה והתאם לנפח סופי של 10 מ"ל. קבע את ריכוז החלבון ולאחר מכן התאם אותו ל-6.5 מ"ג/מ"ל. הוסף אזולקטין במינון של 5 מ"ג/מ"ל ו-0.85 (w/w) Zwittergent 3-14. הערה: יש להוסיף אזולקטין ו-Zwittergent 3-14 טיפה אחר טיפה.</li>
	<li>הומוגניזציה של המתלים והצנטריפוגה (100,000 × גרם) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. אוספים את הסופרנטנט ומדללים 1:2 עם 2 מ"מ של EGTA (pH 7.2).</li>
	<li>יוצקים את התרחיף בעדינות על שיפוע ריכוז טרהלוז לא רציף (45, 40, 35 ו-30% משקל/נפח) ב-10 מ"מ של Tris-HCl, pH 7.0, 1 מ"מ של EDTA, 0.1% דאוקסיכולט ו-1 מ"ג/מ"ל אזולקטין. צנטריפוגה (100,000 × גרם) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 14 שעות. אוספים את הגלולה השקופה והמעט צהבהבה שנוצרה בתחתית הצינורות. הערה: יש לבצע הן את היווצרות שיפוע הטרהלוז והן את הוספת תרחיף הדגימה בטכניקות מתאימות. מומלץ לבצע צנטריפוגה למשך הלילה.</li>
	<li>תלו בעדינות את הגלולה בנפח קטן (&lt;1.5 מ"ל) של 25 מ"מ של Tris-HCl, pH 7.5, 0.3 של M KCl, 45% גליצרול ו-2 מ"מ של EDTA. קבע את ריכוז החלבון. התאם את ריכוז החלבון על ידי דילול ל-2 מ"ג/מ"ל. קח כמויות (~50 מיקרוליטר) של התרחיף ואחסן את ה-SERCA המטוהר ב-72 מעלות צלזיוס עד השימוש בו.</li>
	<li>בצע SDS-PAGE של SERCA72 המטוהר, ושל דגימות חלבון שנלקחו בשלבים שונים של טיהור. מכתים את הג'ל בכחול Coomassie72. הערה: השימוש ב-0.6 M טרהלוז במקום גליצרול במאגר התרחיף מגביר את יציבות האנזים במהלך מחזורי האחסון וההקפאה-הפשרה 28,29.</li>
</ol>
3. בדיקה לפעילות ATPase (תזמון, 1 - 2 שעות)
<ol>
	<li>בדיקה מצומדת אנזימים: ATPase-Piruvate קינאז-לקטט דהידרוגנאז<ol>
		<li>הכן את תערובת התגובה (1 מ"ל): 50 מ"מ MOPS (pH 7.0), 1 מ"מ EGTA, 80 מ"מ KCl, 5 מ"מ MgCl2, 3 מ"מ CaCl2, 5 מ"מ פוספואנולפירובאט, 250 מיקרומטר NADH. כלול ריכוזי ATP משתנים (0.001 עד 0.25 מ"מ).</li>
		<li>הומוגניזציה בזהירות של בדיקת התגובה על ידי מערבולת. דגרו את בדיקת התגובה ב-37 ◦C למשך 10 דקות. הוסיפו 0.9 U L-lactate dehydrogenase (LDH) ו-1.5 U pyruvate kinase (PK).</li>
		<li>התחל את תגובת ATPase על ידי תוספת של 10 מיקרוגרם של SERCA.</li>
		<li>קבע את היווצרות NADH. עקוב אחר השינוי בעוצמת הספיגה בכל שנייה במשך 600 שניות באורך גל (λ) של 340 ננומטר לאורך זמן באמצעות ספקטרופוטומטר עם מחזיק תא תרמוסטט. הערה: מרווח הזמן למדידת הספיגה יכול להשתנות, אך נסה לרשום כמה שיותר נקודות נתונים כדי לצייר את הקו הישר הראשוני של תגובת ה-ATPase.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>קבע את קצב הידרוליזה של ATP הערה: לפרטים על ההליך, עיין ב-Rivera-Morán et al.46.<ol>
		<li>חשב את ערך השיפוע (Δabs/min) של החלק הליניארי בכל עקומה שנוצרה. השתמש במקדם ההכחדה המולארי (ε) של NADH (λ = 6,220 M−1·cm−1) כדי לקבוע את פעילות ה-ATPase (μmoles ATP הידרוליזה/min.mg prot.)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>קבע את הפרמטרים הקינטיים Km ו - Vmax
	<ol>
		<li>שרטט את נתוני המהירות מול ריכוז ה-ATP באמצעות תוכנת ניתוח נתונים וגרפים.</li>
		<li>התאם את הנתונים על ידי רגרסיה לא ליניארית למשוואת מיכאליס-מנטן (שווה ערך 1)46: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67748/67748eq01.jpg" style="margin: auto;"> כאשר v היא המהירות, Vmax היא המהירות המקסימלית, [S] הוא ריכוז ה-ATP, ו-Km הוא קבוע מיכאליס-מנטן.</li>
		<li>קבע Km ו - Vmax על ידי איטרציה. הערה: הכללת DOC עשויה להגביר את תגובת קצב ה-ATPase; מומלץ לבדוק ריכוזים שונים של DOC כדי למצוא את האופטימלי.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. בדיקת תיוג של SERCA עם פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) (תזמון, 30 - 45 דקות, רק לתיוג FITC)
הערה: לפרטים על ההליך, עיין ב-54,75,76.
<ol>
	<li>השהה SERCA (20 מיקרוגרם) ב-50 מיקרוליטר (נפח סופי) של מאגר תיוג (100 מ"מ של KCl, 5 מ"מ MgCl2 ו-30 מ"מ של Tris-HCl, pH 8.9) המכיל 1 מ"מ של FITC. מערבבים על ידי מערבולת.</li>
	<li>דגרו את הדגימות בזמנים שונים (15 דקות, 10 דקות, 7 דקות, 5 דקות ו-2 דקות) בחושך ובטמפרטורת החדר.</li>
	<li>עצור את תגובת התיוג על ידי הוספת נפח אחד של מאגר עצירה קר כקרח (480 מ"מ סוכרוז ו-48 מ"מ MOPS, pH 7.0), המכיל ATP (5 מ"מ). דגירה על קרח במשך 5 דקות בחושך.</li>
	<li>הכפיף את ה-SERCA שכותרתו FITC ל-SDS-PAGE72. חשוף את הג'לים השקופים לאור UV (λ = 302 ננומטר). תצלום מתעד את התוצאה.</li>
	<li>מכתימים את הג'ל בכחול Coomassie. תצלום מתעד את התוצאה. הערה: ביצוע תיוג FITC בחדר חשוך עשוי לשפר את איכות אות הקרינה.</li>
</ol>
5. ספקטרום דיכרואיזם מעגלי (CD) (תזמון, 30 דקות)
הערה: לפרטים על ההליך, עיין בסעיף11,77.
<ol>
	<li>השהה SERCA (3 מיקרומטר) ב-400 מיקרוליטר של מאגר פוספט של 10 מ"מ (pH 7.0) ב-25 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>טען את הדגימה בתא באורך נתיב של 0.1 ס"מ. הגדר טווח λ של ספקטרום UV רחוק בין 190-260 ננומטר. הגדר את הרזולוציה הפנימית ואת רוחב הפס ל -1 ננומטר.</li>
	<li>הקלט את אות התקליטור ב-50 ננומטר/דקה ב-25 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>אזולקטין מפולי סויה</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>44924</td><td></td></tr><tr><td>משדר UV שולחני&nbsp;</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-97623-08</td><td>הגדרה גבוהה בעוצמה כפולה היא אידיאלית לתיעוד אנליטי. הגדרה נמוכה מפחיתה פוטוניקה או פוטו-הלבנה של דגימות ג'ל בזמן ביצוע עבודת הכנה.</td></tr><tr><td>CaCl2 &bull; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת Coolpix B500&nbsp;</td><td>Nikon Corp</td><td>S210</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie כחול מבריק G-250</td><td>Bio-Rad</td><td>1610406</td><td></td></tr><tr><td>Dodecyl maltoside</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>אתילן גליקול-ביס(2-aminoethylether)-N,N,N&prime;,N&prime; -חומצה טטראצטית</td><td>, Sigma-Aldrich Corp</td><td>E4378</td><td></td></tr>, <tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית, מלח טטרסודיום דיהידרט&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>E6511</td><td></td></tr><tr><td>פלואורסצאין איזותיוציאנט</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>F3651</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>JT Baker</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 &bull; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Chem-Impex אינטרנשיונל בע"מ</td><td>230</td><td></td></tr><tr><td>N-tetradecyl-N,N- dimethyl-3-ammonium-1-propanesulfonate</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>D0431</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoenolpyruvate (PEP)</td><td>Chem-Impex International Inc</td><td>9711</td><td></td></tr><tr><td>שריר ארנב לקטט דהידרוגנאז</td><td>Roche</td><td>10003557103</td><td></td></tr><tr><td>שריר ארנב פירובט קינאז</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>P1506</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולאט</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>Bio-Rad</td><td>1610302</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופולארימטר&nbsp;</td><td>חברת ג'סקו</td><td>ג'סקו J1500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ' קורפ</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>טרהלוז</td><td>סיגמא-אולדריץ' קורפ</td><td>T0167</td><td>דיהידראט</td></tr><tr><td>טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאן הידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>קורפ 857645</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן</td><td>אופטימה XPN</td><td></td></tr><tr><td>UV/VIS ספקטרופוטומטר&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>8453</td><td>ספקטרופוטומטר UV-Vis Agilent 8453 משתמש במערך פוטודיודות למדידה בו-זמנית של ספקטרום האור האולטרה סגול עד הנראה השלם</td></tr><tr><td>WiseStir HS- 30E</td><td>Daihan Scientific Co.</td><td>ד. WOS01010</td><td>אידיאלי לכל היישומים המפרקים וההומוגניים, המיועד למטחנות רקמות.</td></tr></tbody></table>

טיהור הרטיקולום הסרקו-אנדופלזמי ca2+-atpase משריר הארנב

Purification of the Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase from Rabbit Muscle

SDS-PAGE של SERCA בשלבים שונים של טיהור (איור 1). הג'ל המוכתם בכחול של Coomassie מראה את ההעשרה של רצועת החלבון SERCA (משקל מולקולרי לכאורה &gt;100 kDa) ככל שפרוטוקול הטיהור מתקדם. רצועת החלבון המתאימה ל-SERCA מציגה טוהר של &gt;90% לאחר צנטריפוגה בשיפוע ריכוז טרהלוז. תרשים של קצב הידרוליזה של ATP לעומת ריכוז ATP (איור 2A). Michaelis-Menten ATPase קינטי (דפוס היפרבולי) נצפה עבור SERCA המטוהר. תרשים Lineweaver-Burk של הנתונים באיור 2A...

טיהור הרטיקולום הסרקו-אנדופלזמי Ca2+-ATPase משריר הארנב

Some P-type ATPases, such as sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA), are inherently labile membrane proteins that require specific ...

purification-sarco-endoplasmic-reticulum-ca2-atpase-from-rabbit

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

אנו מתארים שיטה לכימות הפעילות של ATPases מסוג P-countertransport K+ על ידי ביטוי הטרולוגי של האנזימים בביציות Xenopus ומדידת קליטת Rb+ או Li+ לתאים בודדים על ידי ספקטרופוטומטריית ספיגה אטומית. השיטה מהווה אלטרנטיבה רגישה ובטוחה לניסויי שטף רדיואיזוטופים המאפשרים מחקרים קינטיים מורכבים.

מדידת תחבורת קטיון ידי Na, K-ו-H, K-ATPase ב<em&gt; Xenopus</em&gt; ביציות על ידי spectrophotometry קליטה האטומית: חלופית למבחני radioisotope

מאמר זה מתאר את הפרוטוקול מפורט וציוד הכרחי למיפוי כפול אופטי של (מ 'V) פוטנציאל הטרנסממברני וחופשי רשתית תוך-sarcoplasmic (SR) Ca 2 + בלב ארנב Langendorff-perfused. שיטה זו מאפשרת לתצפית ישירה וכימות של מטר V ו2+ דינמיקת Ca SR בלב שלם.

מיפוי אופטי של Intra-sarcoplasmic reticulum Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ופוטנציאל הטרנסממברני בלב ארנב Langendorff-perfused

הומאוסטזיס סידן ברטיקולום אנדופלזמי מופרע בפתולוגיות מגוונות.  ניתן להשתמש במדווח חלבון ניטור סידן מופרש (SERCaMP) כדי לזהות שיבושים במאגר הסידן של ER.   פרוטוקול זה מתאר את השימוש ב-Gaussia luciferase SERCaMP לבחינת הומאוסטזיס סידן ER במבחנה וב-vivo.

ניטור הומאוסטזה סידן endoplasmic reticulum שימוש<em&gt; Gaussia</em&gt; לוציפראז SERCaMP

נכון לעכשיו, רוב מדדי הסידן הזמינים משמשים לכימות מעברי סידן ציטופלזמיים כמדדים עקיפים של סידן המשתחרר מהרטיקולום הסרקופלזמי בתאי שריר חלק מתורבתים. פרוטוקול זה מתאר את השימוש באינדיקטור ספציפי מבוסס FRET המאפשר מדידה ישירה של אותות סידן בתוך לומן הרטיקולום הסרקופלזמי.

מדידת תנודות סידן בתוך הרטיקולום sarcoplasmic של בתאי שריר חלק בתרבית באמצעות מבוססי סריג הדמיה Confocal

סידן תאיים מיחזור שמשחק תפקיד בוויסות של תפקוד סיסטולי, דיאסטולי אצל cardiomyocytes. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי להעריך sarcoplasmic רשת Ca2 + שמורת ובפונקציה הסרת סידן הדיאסטולי ב cardiomyocytes מאת סידן מערכת הדמיה.

הערכה של רשת Sarcoplasmic סידן סידן הדיאסטולי שימור, תאיים הסרת Cardiomyocytes חדרית מבודד

אנו מציגים פרוטוקולים ליישום של מחוון סידן מקודד גנטית ממוקד גנטית (GECI) Catcher + לניטור מהיר trans סידן ב reticulum endoplasmic / sarcoplasmic (ER / SR) של HEK293 ו שלד שריר תאים C2C12 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בזמן אמת. פרוטוקול למדידה באתרו K d וכיול נדון גם.

ניטור ER / SR סידן שחרור עם CA ממוקד<sup&gt; 2+</sup&gt; חיישן Catcher<sup&gt; +</sup

פרוטוקול זה מתאר את הטיהור של F1-ATPase משלב חרקים בתרבית של Trypanosoma brucei. ההליך מניב מורכב מאוד טהור, הומוגנית, פעיל מתאימים ללימודי אנזימטי מבניים.

בידוד F1-ATPase מ פרוטיסטים טפילי Trypanosoma brucei

המיטוכונדריה הם אברונים מטבוליים מרכזיים המציגים רמה גבוהה של פלסטיות פנוטיפית בשריר השלד. ייבוא חלבונים מן הציטוסול הוא מסלול קריטי עבור biogenesis אברון, חיוני להרחבת הרשתית ותחזוקה של תפקוד מיטוכונדריאלי.  לכן, יבוא חלבון משמש ברומטר של בריאות התא.

מדידה של קיבולת ייבוא חלבון של המיטוכונדריה שריר השלד

פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר היא שיטה לחקר תנועות תחום החלבונים בזמן אמת. שינוי טכניקה זו ליישומה בתאים מקומיים מאפשר כעת זיהוי ומעקב אחר תנועות חיישן מתח יחיד מתעלות Ca2+ מגודרות מתח בסיבי שריר שלד מבודדים.

פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר בתאים מקומיים לחקר עוררות שרירי השלד

פרוטוקול זה מפרט את ההליכים לייצור רקומביננטי של ההולואנזים מיוזין-7a האנושי באמצעות מערכת MultiBac Baculovirus ולחקר תנועתיותו באמצעות בדיקת גלישה מותאמת אישית של חוטי להט במבחנה.

טיהור מבוסס מערכת MultiBac ואפיון ביופיזי של מיוזין-7a אנושי

למדו שיטה משופרת לטיהור SERCA משריר ארנב באמצעות טרהלוז לייצוב חלבונים. השיטה מייצרת SERCA בטוהר של מעל 90% עם פעילות קטליטית גבוהה למחקרים מבניים ותפקודיים.

טיהור הרטיקולום הסרקו-אנדופלזמי Ca²⁺-ATPase משריר הארנב

גלה סרטונים נוספים