מיצוי וניקוי רקמות הכנת דגימות מוח-חוט שדרה של עכברים

המחקר שלנו מתמקד באופן שבו מערכת העצבים המרכזית מתווכת את התפקודים הקוגניטיביים, ומקיימת אינטראקציה עם מערכת החיסון. אנו שואפים לשפר את השיטות לבחינת המוח וחוט השדרה, תוך התייחסות לשאלות הבסיסיות לגבי אינטראקציות אלה. שיטות אלה שומרות על כל המוח וחוט השדרה שלמים, מה שמסייע לנו למפות את התא בצורה יסודית יותר באמצעות ניקוי רקמות. זה גם הופך את התהליך למהיר ומדויק יותר, ומפחית את הזמן והטעויות בהשוואה לשיטות החיתוך וההדמיה המסורתיות.

מיפינו את אזורי המוח וחוט השדרה המחוברים לריאות ומניבים . המחקר שלנו יתמקד בחקר התקשורת הנוירו-אימונית בין המוח, חוט השדרה והריאות. וכיצד אינטראקציה זו משפיעה על תגובות חיסוניות.

[מדריך] כדי להתחיל, תקן את גפי העכבר ללוח האקרילי הרחב באמצעות מלחציים מפלדה. בעזרת מספריים חותכים את העור בין שתי עצם הירך וממשיכים לחתוך כלפי מעלה עד שמגיעים לסרעפת. פתחו את שני צידי בית החזה דרך הסרעפת, בעזרת מספריים ומלקחיים ישרים כדי לחשוף את הלב. הכנס מחט עירוי 0.7 מילימטר המחוברת לצינור זלוף לחדר השמאלי, ובצע חתך של מילימטר עד שניים בתוספתן הפרוזדורים הימני. לאחר הזלוף, הפרד את העור בגב ובראש העכבר באמצעות מספריים עיניים. חתכו את עמוד השדרה בנקודה שבה הקו המחבר את הקצוות האחוריים העליונים של שתי הגפיים מצטלב עם עמוד השדרה הסר רקמת שריר ושומן מהצוואר והחלק האחורי של העכבר כדי לחשוף את עמוד השדרה והגולגולת. בעזרת מספריים ורידיים, חותכים לאורך פער קו האמצע בין הצד השמאלי והימני של עמוד השדרה וחוט השדרה מהקצה התחתון של תעלת החוליות. לאחר מכן הסר את החלק העליון והצדדים הדו-צדדיים של עמוד השדרה הקטוע כדי לחשוף את חוט השדרה. חזור על השלבים עד שתגיע לחיבור המוח. הניחו את קצה הלהב האחד של המספריים הוורידיים בין הנקב המגנום למוח. החלק וחתוך לאורך התפר האמצעי כדי לפתוח את הגולגולת. השתמש במלקחיים כדי להסיר את הגולגולת ולחשוף את המוח. כעת, בעזרת מלקחיים ומספריים ורידיים, הסר את רקמת חוט השדרה של מוח העכבר מקצה הגולגולת. השתמש במלקחיים מנתחים כדי להסיר את קרום חוט השדרה מתחת למיקרוסקופ הסטריאו. לאחר מכן, בעזרת תפרים, אבטח את דגימת חוט השדרה במוח לצלחת הקיבוע. הוסף לפחות פי 20 מנפח הדגימה של 4% פרפורמלדהיד. לאחר הקיבוע, השליכו את הפרפורמלדהיד ושטפו את הדגימה שלוש פעמים עם PBS. כדי להתחיל, תקן את חוט השדרה של מוח העכבר שחולץ בפרפורמלדהיד. לתמיסה להסרת שומנים, מערבבים תמיסה A ו-B ביחס מסה של תשע לאחד. הוסף 50 מיליליטר מתמיסת הסרת השומנים לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר והניח בו את הרקמה הקבועה. לאחר הדגירה בתמיסה C, החלף את התמיסה והניח את צלחת התרבות עם הדגימה שקועה במלואה בתמיסה C על קופסת אור עם קו אבנית. להכנת תמיסת ג'ל, הוסיפו 147 גרם תמיסה C ושלושה גרם אגרוז לבקבוק זכוכית של 200 מיליליטר. מערבבים היטב את הרכיבים בעזרת מוט ערבוב, ואז מיקרוגל עד שהאגרוז נמס. מעבירים את תמיסת הג'ל לתנור מעבדה המכוון ל-37 מעלות צלזיוס. יוצקים לתוך התבנית שכבה בעומק שני מילימטר של תמיסת ג'ל מחוסמת 37 מעלות, ומצננים אותה במקרר של ארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד שהיא חצי מוצקה. הכניסו את הדגימה התואמת לאינדקס השבירה לתוך התבנית, והוסיפו תמיסת ג'ל עד לרמה או מעט מתחת לחלק העליון של הדגימה. מחזירים את התבנית למקרר של ארבע מעלות צלזיוס לשעתיים. מכסים בתלוש כיסוי ומכניסים שוב למקרר. הסר את החלקת הכיסוי בעזרת פינצטה והוציא את הדגימה המוטמעת. הוסף 30 מיליליטר של תמיסת הדמיה לצינור של 50 מיליליטר וטבל את הדגימה בתמיסה. מרחו דבק 502 כדי להדביק היטב את הדגימה על מחזיק הדגימה, לפני קיבוע המחזיק על מכשיר ההדמיה. הפעל את תוכנת הסריקה ובחר את רמת ההגדלה פי 4 במקטע ההגדלה. לחץ על לחצן הכיול כדי להפעיל את מצב הכיול. לחצו על לחצן התצוגה המקדימה כדי להיכנס למצב תצוגה מקדימה. לאחר מכן לחץ על כפתור תנועת כיוון Z כדי להזיז לאט את הדגימה כלפי מעלה מתחתית תא הדגימה עד שיריעת האור שנוצרה תעבור דרך הדגימה. בחר את ערוץ הלייזר ואפשרות מצב התאורה המתאימים. בחר את כיוון נתיב הסריקה עבור הדגימה. לחץ על כפתור הסריקה האוטומטית כדי להתחיל לצלם את התמונות של הדגימה. הפרוטוקול שימר בהצלחה את כל מוח העכבר וחוט השדרה תוך שמירה על אותות פלואורסצנטיים שלמים להדמיה ברורה. ההדמיה הפלואורסצנטית של דגימת חוט השדרה במוח הדמיגה בבירור מבנים עצביים מפורטים. תמונות הגדלה גבוהות יותר סיפקו הדמיה משופרת של תאים בודדים המסומנים בפלואורסצנט.