אסטרטגיית הפרעות CRISPR כפולות למיקוד אינטראקציות קטלניות סינתטיות בין RNA לא מקודדים בתאים סרטניים

המטרה שלנו היא לזהות באופן שיטתי ולמקד טיפולית למרכזי רשת קריטיים תוך התמקדות ב-RNA לא מקודד בסרטן. האתגר הניסויי הנוכחי של הגישה שלנו טמון ביכולת הקומבינטורית הנדרשת כדי ליצור ולסנן מספר רב של גנים במקביל. אנו שואפים לסלול את הדרך לזיהוי מטרות RNA קומבינטוריות חדשות שאינן מקודדות או מבנים הניתנים לתרופה כדי לעקוף עמידות ובריחה טיפולית.

בעתיד, נתרגם את כלי הוכחת ההיתכנות הזה למאמצי סינון ספריות קומבינטוריות בקנה מידה גדול, פוטנציאלית בשילוב עם חלבונים קושרי RNA, הן במבחנה והן במבחנה. כדי להתחיל לספור תאי Lenti-X 293T HEK באמצעות צבע כחול טריפן בהמוציטומטר. צלחת 4 כפול 10 בחזקת 6 תאי Lenti-X 293T HEK לכל צלחת של 10 סנטימטר ודגירה כדי להשיג כ-80% מפגש למחרת.

משלב זה ואילך, עבוד במעבדה מסוג 2. מערבבים 500 מיקרוליטר של מדיום טרנספקציה מתאים עם וקטור העברה, פלסמיד מעטף ווקטור pPAX2. דגרו את התערובת במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

בשפופרת נפרדת, מערבבים 500 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת עם 36 מיקרוליטר של מגיב PEI בריכוז של 1 מיליגרם למיליליטר. דגרו את התערובת במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שלב את שתי התערובות ודגר במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

כעת בזהירות, טיפה, מוסיפים את התערובת למדיום התא המכיל שישה מיליליטר ודוגרים למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני. לאחר 12 עד 15 שעות, השליכו את המדיום לבקבוק פסולת הניתן לחיטוי באמצעות פיפטה סרולוגית. שטפו חומרים מתכלים, כולל פיפטות סרולוגיות וקצות פיפטות, בתמיסת חיטוי לפני השלכתם לפסולת החיטוי.

הוסף חמישה מיליליטר של DMEM טרי לתאים שעברו טרנספטציה באמצעות פיפטה חדשה. כדי לקצור נגיפי לנטי, העבירו את הסופרנטנט באמצעות פיפטה סרולוגית לצינור קנוני של 50 מיליליטר, 48 שעות לאחר הטרנספקציה. לאחר מכן הוסיפו 5 מיליליטר מדיום טרי לתאים ודגרו אותם למשך 24 שעות נוספות.

אחסן את הצינור במקרר. לאחר הדגירה, חזור על איסוף ה-lentiviruses ואגד אותו עם הדגימה שנאספה קודם לכן. לאחר הקציר השלישי, החנות שילבה סופרנטנטים של כל שלושת הקצירים בארבע מעלות צלזיוס עד לסינון וצנטריפוגה.

צנטריפוגה את הסופרנטנט המשולב למשך 5 דקות בטמפרטורה של 500 גרם ו-4 מעלות צלזיוס במיכלים אטומים לאירוסול ורוטורים המאושרים לאורגניזמים מקבוצת סיכון 2, ולאחר מכן מסננים את הסופרנטנט דרך מסנני מזרק בדרגת תרבית תאים סטריליים של 0.2 מיקרומטר. רכז את הסופרנטנט המסונן ב-1000 גרם וארבע מעלות צלזיוס באמצעות יחידת סינון צנטריפוגלית עם חתך משקל מולקולרי של 100 קילודלטון לכ-500 מיקרוליטר. אחסן כמויות וירוסים של 50 עד 100 מיקרוליטר במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

צלחת 501 תאים בצלחת שש בארות ב-2 כפול 10 בחזקת 5 תאים לבאר עם נפח תרבית סופי של 2 מיליליטר יום אחד לפני ההעברה. החלף את מדיום התרבות ב -2 מיליליטר של DMEM מחומם מראש בתוספת פוליברן בריכוז סופי של 6 מיקרוגרם למיליליטר. עבוד במעבדה מסוג 2 משלב זה ואילך.

הוסף 50 מיקרוליטר של נגיפי SPD ו-SAD מוכנים בו זמנית לתאים עם טיפה. יש לנער את הצלחת בעדינות ולדגור אותה בחום של 37 מעלות צלזיוס באווירה של 5% פחמן דו חמצני. 16 שעות לאחר ההתמרה השליכו את המדיום לבקבוק הניתן לחיטוי באמצעות פיפטה סרולוגית.

הוסף 2 מיליליטר של מדיום טרי המכיל 10 מיקרוגרם למיליליטר בלסטיצידין ו -2 מיקרוגרם למיליליטר פורומיצין. חזור על שלב ההחלפה הבינונית לאחר יומיים וטפל בתאים שעברו התמרה בתנאי S1 לאחר שבעה ימים לאחר ההעברה. זרע 0.1 כפול 10 בחזקת 5 תאים המכילים SadCas9 KRAB ו-Sp-dCas9-KRAB יציבים שבעה ימים לאחר ההעברה בצלחת של 96 בארות עם 100 מיקרוליטר של DMEM מחומם מראש.

ביום ההעברה, החלף את המדיום ב -100 מיקרוליטר של DMEM מחומם מראש בתוספת פוליברן ב -6 מיקרוגרם למיליליטר. הוסף את הנפח המתאים של נגיפי לנטי לתאים ודגר את הצלחת. לאחר 16 שעות, החלף את המדיום במדיום טרי המכיל זאואין, בלסטידין ופורומיצין.

בצע זיהוי זוהר חמישה ימים לאחר הטרנסדוקציה באמצעות בדיקת כדאיות תאים בהתאם להוראות היצרן. ניתוח דם מערבי אישר ביטוי מוצלח של חלבוני היתוך SpdCas9 ו-SadCas9 בתאי מתמר 501-mel. ניתוח כמותי של תגובת שרשרת פולימראז הראה הפלה יעילה של RNA ארוכים שאינם מקודדים RP11 ו-XLOC באמצעות RNA מנחה ספציפי, אך רק זוג XLOC-sa ו-RP11-sp דיכאו בהצלחה את שתי המטרות בו זמנית.

דיכוי כפול של RP11 ו-XLOC באמצעות זוג XLOC-sa ו-RP11-sp GRNA הפחית משמעותית את כדאיות תאי 501-mel ל-59% בהשוואה לביקורת.