שיטה יעילה לחילוץ אפיתל חצוצרות אנושיות לאנליזות של תאים בודדים

המחקר שלנו מתמקד בהבנה ובמאבק בעמידות לכימותרפיה בסרטן השחלות. אנו שואפים לגלות מנגנונים ותת-אוכלוסיות תאים המניעים עמידות ומטרות חדשות למיגור האוכלוסיות האגרסיביות הללו.

ריצוף RNA של תא בודד מקל על אפיון תת-אוכלוסיות בגידולי שחלות הטרוגניים. אנו ממנפים תאי אפיתל של חצוצרות לא סרטניות כתא מקור נורמלי לניתוחי סרטן השחלות.

בידוד יעיל של תאי אפיתל של חצוצרות לתרחיף חד-תאי מועשר יסייע בהבנה נוספת של התחלת מחלת סרטן שחלות סרוזית בדרגה גבוהה. טכניקת עיכול מכנית ואנזימטית זו מציעה תהליך יעיל יותר לחילוץ תרחיף חד-תאי מועשר של תאי אפיתל חצוצרות ברי קיימא.

[קריין] כדי להתחיל, אסוף חצוצרות אנושיות טריות בצינור של 15 או 50 מיליליטר המכיל חומר דיסוציאציה והנח את הצינור על קרח. העבירו את החצוצרות לצלחת פטרי סטרילית המכילה חומר דיסוציאציה טרי והניחו את הדגימה תחת מיקרוסקופ חיתוך. כעת, בעזרת מלקחיים עדינים ומספריים של Vannas-Tubingen, נתחו שומן, רקמת חיבור וכל כלי דם המקיפים את הצינורות. לאחר מכן, חתכו את מישור העטרה של החצוצרות בעזרת מספריים ליצירת גלילים קטנים בקוטר של שלושה עד חמישה מילימטרים. השתמש במלקחיים עדין=נקודה כדי לייצב את הרקמה בזמן החיתוך. שאפו בזהירות את אמצעי הדיסוציאציה מהצלחת המכילה את חתיכות הרקמה. שוטפים את חתיכות הרקמה פעמיים עם שני מיליליטר PBS קר 1x וסובב קלות את הצלחת. לאחר שאיבת ה-PBS, דגרו את חתיכות הרקמה למשך חמש דקות ב-EDTA קר של חמישה מילי-מולרים בטמפרטורת החדר. השעו את שברי הרקמה בתמיסת מלח מאוזנת 1% טריפסין הנקס ודגרו בארבע מעלות צלזיוס למשך 40 דקות. יש לשאוף את תמיסת המלח המאוזנת של 1% טריפסין הנקס ולשטוף את חתיכות הטישו פעמיים במדיית דיסוציאציה קרה כדי לנטרל את הטריפסין. דגרו את שברי הרקמה בשני מיליליטר של אמצעי דיסוציאציה עם 0.4 מיליגרם DNase למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. תחת מיקרוסקופ מנתח בעודך במדיה DNase, החזק שבר של החצוצרה בעזרת מלקחיים כך שהלומן יהיה מקביל לתחתית הצלחת. השתמש במלקחיים כדי ללחוץ שוב ושוב על הרקמה כדי להוציא תאי אפיתל מהלומן. אשר שחרור של הילה של תאים סביב הרקמה. העבירו את התאים המכילים מדיה לצינור סטרילי של 15 מיליליטר. שטפו את צלחת הפטרי פעמיים באמצעי דיסוציאציה ושלבו שטיפות באותו צינור. השלך את שברי צינור הסטרומה הנותרים. כדי לקצור את התאים, צנטריפוגה אותם ב -500 גרם למשך חמש דקות. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיה דיסוציאציה. כעת, מערבבים 10 מיקרוליטר של תרחיף תאים עם נפח שווה של טריפאן כחול. פיפטה 10 מיקרוליטר מהתערובת לתוך שקופית ספירת תא והכניסה אותה למונה תאים כדי לקבוע את ספירת התאים. השעו מחדש את התאים בתשעה מיליליטר של אמצעי דיסוציאציה המכילים קולגנאז מסוג 1 ו-DNase. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 45 דקות בשייקר מסלולי המוגדר ל-200 סל"ד. כדי לקצור את התאים, צנטריפוגה בחום של 500 גרם למשך חמש דקות. לאחר שאיבת הסופרנטנט, השעו מחדש את הכדור בחמישה מיליליטר של חומר דיסוציאציה כדי לשטוף את הקולגנאז. העבירו את מתלה התא דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מיליליטר וצנטריפוגה את המסנן ב-500 גרם למשך חמש דקות. אם כדורית התא נראית אדומה, הכינו מאגר ליזה של RBC כדי ליז את כדוריות הדם האדומות. שאפו את המדיה מהגלולה, הוסיפו חמישה מיליליטר ממאגר הליזיס המדולל של RBC ודגרו את הדגימה על קרח למשך שלוש דקות. כדי לעצור ליזיס RBC, הוסף 45 מיליליטר של 1x PBS לצינור. צנטריפוגה את הצינור בחום של 500 גרם למשך חמש דקות. לאחר קציר והשעיה מחדש של התאים במיליליטר אחד של אמצעי דיסוציאציה, מערבבים 10 מיקרוליטר של תרחיף התאים עם נפח שווה של טריפאן כחול. פיפטה 10 מיקרוליטר מהתערובת לתוך שקופית ספירת תא והכניסו אותה לדלפק התאים. ניתוח ציטומטריית זרימה אישר בידוד של אוכלוסיית תאי אפיתל בת קיימא ומועשרת מרקמת החצוצרות עם כדאיות ממוצעת של 82%. לאחר הוצאת תאי חיסון חיוביים ל-CD45, תאי אפיתל חיוביים ל-EpCAM היוו בממוצע 80% מהדגימה, בעוד שזיהום תאי סטרומה חיוביים ל-CD10 היה מינימלי ב-7.8%. תאי אפיתל מבודדים יצרו אשכולות דמויי אבן מרוצפת בתרבית דו-ממדית לאחר ארבעה עד שישה ימים של ציפוי, המאשרים את זהות האפיתל. אימונוכימיה גילתה שרוב התאים המתורבתים ביטאו EpCAM ו-PAX8 עם רק כמה תאים חיוביים לווימנטין. תאים ריסניים היו נוכחים בתרבית.