שיטת QuEChERS-HPLC שונה לזיהוי פחמימנים ארומטיים פוליציקליים בעוברי דג זברה שנחשפו לחלקיקים עדינים

מחקר זה נועד לפתח שיטת QuEChERS-HPLC מותאמת לכימות PAHs בעוברי דג זברה שנחשפו ל-EOM, תוך התייחסות לפער הנוכחי הנגרם על ידי אתגרים טכניים במדידת רמות PAHs פנימיות בשל גודל המסה של העוברים ומורכבות המטריצה הביולוגית שלהם. השגת תוצאות אמינות דורשת 200 עוברים לקבוצה, מה שמהווה אתגר מעשי. שילוב HPLC עם גלאי פלואורסצנטי יכול לשפר עוד יותר את רגישות השיטה. בהשוואה לטכניקות אחרות, שיטת QuEChERS-HPLC שונה זו מפחיתה משמעותית את זמן ההשהיה של הדגימה ומספקת גישה מהירה ויעילה לניתוח הרמות של 16 PAHs בעוברי דג הזברה שנחשפו ל-EOM.

[קריין] כדי להתחיל, הכינו את דגימת QuEChERS על ידי הוצאת הכלים המכילים את העוברים מהאינקובטור 72 שעות לאחר ההפריה. שטפו את העוברים שלוש פעמים במים טהורים. העבירו את העוברים לצינורות של 1.5 מיליליטר והוציאו עודפי מים. הכניסו את הצינורות למקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לליופיליזציה של העוברים. לאחר הליופיליזציה, טוחנים את העוברים באמצעות מוט זכוכית. הוסף 25 מיקרוליטר של 16 פחמימנים ארומטיים פוליציקליים, או PAH, תמיסה סטנדרטית לקבוצת הבקרה DMSO כדי לבדוק התאוששות ספייק. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של n-הקסאן ומערבולת למשך 30 שניות. אולטרסאונד את התערובת בחום של 35 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. כעת, צנטריפוגה את הדגימה ב-7,000 גרם למשך חמש דקות. העבירו את הסופרנטנט לתוך שפופרת טרייה. אידוי הסופרנטנטים שנאספו ליובש תחת זרימת חנקן באמבט מים של 35 מעלות צלזיוס. הוסף מיליליטר אחד של אצטוניטריל ומערבולת למשך 30 שניות. הוסף לדגימה 10 מיליגרם של אמין משני ראשוני, 45 מיליגרם מגנזיום גופרתי ו-15 מיליגרם של אריזת C18, ולאחר מכן מערבולת למשך 30 שניות. צנטריפוגה ב-7,000 גרם למשך חמש דקות ומעבירים את הסופרנטנט לתוך צינור טרי. לאדות את הסופרנטנט ל-0.5 מיליליטר מתחת לחנקן ולסנן את הדגימה דרך ממברנה מיקרו-נקבובית של 0.22 מיקרומטר. הכן סדרה של פתרונות עבודה הנעים בין 1 ל-500 ננוגרם למיליליטר עבור תקן תערובת 16 PAH באמצעות אצטוניטריל. הזרקו 20 מיקרוליטר מתמיסות הדגימה לתוך כרומטוגרף נוזלי באמצעות שלב אצטוניטריל או נייד מים ובצע את הליך הפליטה המוצג על המסך. שרטט עקומה סטנדרטית עם ריכוזי מסה של פתרונות העבודה הסטנדרטיים על ציר ה-x ואזורי השיא המתאימים על ציר ה-y, המכסה טווח שבין חמישה ננוגרם למיליליטר ל-500 ננוגרם למיליליטר. הזרקו את הדגימה המטוהרת לתוך הכרומטוגרף הנוזלי המצויד בגלאי פלואורסצנטי, או FLD, וגלאי מערך דיודות או DAD. זהה נוכחות של PAHs על ידי השוואת זמני שמירה. מדוד אזורי שיא כדי לקבוע את הריכוז. לבסוף, חשב את הריכוזים הפנימיים של 16 PAHs על סמך ריכוזי המסה הנמדדים. ריכוזי הפחמימנים הארומטיים הפוליציקליים, או PAHs, בעוברי דג הזברה 72 שעות לאחר ההפריה ניתנים בטבלה זו. שישה PAHs זוהו בהצלחה בחומר אורגני הניתן לחילוץ, או EOM, עוברי דג זברה חשופים. לעומת זאת, רק שני PAHs זוהו בדגימות הבקרה של DSMO, ברמות נמוכות משמעותית מאלו בדגימות EOM.