שיטה בעלת תפוקה גבוהה להתבוננות בפנוטיפים של תנועתיות ב-Pseudomonas aeruginosa

המחקר שלנו מתמקד בהבנת האופן שבו חיידקים פועלים וגורמים לזיהומים באמצעות ביולוגיית מערכת וגנומיקה. מטרתנו היא לזהות את הגנים המשפיעים על פיזיולוגיית החיידקים במצב המדמה את סביבת ההדבקה, במטרה למצוא מטרות חדשות לפיתוח אנטיביוטיקות טובות יותר וטיפולים חלופיים. פיתחנו פרוטוקול עתיר תפוקה לזיהוי גורמים גנטיים המשפיעים על תנועתיות Pseudomonas aeruginosa, המאפשר ניתוח גנומי רחב של התנהגויות ההתקדמות והעוויתות. יוזמת מחקר זו חשפה מנגנון מולקולרי המניע תנועתיות התורם גם להיווצרות ביופילם, התיישבות והתחמקות מהגנה על המאכסן.

הוא מסתגל לבדיקות שונות ולמיני חיידקים. כדי להתחיל, קחו את לוחות המקור של ספריית המוטנטים Pseudomonas aeruginosa transposon והשאירו אותם שטוחים על משטח בטמפרטורת החדר למשך כשעה לקרירות. לבדיקה הרצויה, בחרו פלטות M9 גלוקוז 0.5% אגר להתקפות ופלטות LB agar 1% לתנועות.

כדי להגדיר את הרפליקטור להעברת מושבות מדויקת, הפעל את המשכפל. בסעיף 'בחר והפעל' מצב, בחר ב'בחר' והריץ תוכניות מאוחסנות. בסעיף בחר פלטות מקור, בחר פלוס פלטה 384 אגר.

לאחר מכן, בחלק בחירת לוח היעד, בחר פלוס פלטה 384 אגר. בסעיף 'בחר פדים', בחר פין קצר 384. בתוכניות זמר, בחר שכפול רבים, ואז עבור לשכפול אפשרויות התוכנית ובחר 'כללי', 'ממחזר' ו'אין'.

במדור המקור, בחר הסטה, ואז רדיוס אקראי וברירת מחדל. במטרת המקטע, בחר בהצמדה וכוון את הלחץ ל-2% השאר כל ההגדרות כברירת מחדל. לאחר מכן, הכנס את הפין הקצר RePads 384 לתא המתאים.

מקם את לוחות המקור והמטרה על הפלטפורמה המיועדת של הרפליקטור. הנח את לוחות המקור בצפיפות 384 ואת לוחות התנועה הריקים על הפלטפורמה. לחץ על הרצה באמצעות הפרמטרים שנבחרו כדי להתחיל את תהליך ההעברה.

רובוט ההצמדה של מערך מיקרוביאלי יעביר מושבות מלוחות המקור בצפיפות 384 ללוחות התנועה. לאחר מכן, הניחו את לוחות התנועה המחוסנים בשקיות פלסטיק. הנח בזהירות את השקיות המכילות את הצלחות בתוך האינקובטור, ומכוון ל-37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות.

לאחר תקופת הדגירה, ניתן לצלם תמונות ברזולוציה גבוהה של לוחות התנועה באמצעות כל תוכנת הדמיה איכותית. לאחר ביצוע בדיקת התנועתיות והדמיית לוחות התנועה, הרץ את המקרו ב-ImageJ. פתח את התיקייה שמכילה את התמונות כדי לטעון את האצווה לניתוח.

כאשר מתבקשים, שנו את הזווית באמצעות אפשרות התצוגה המקדימה עד שהפלטה ישרה כדי להתאים את סיבוב הפלטה. כשאתה מרוצה, לחץ על כפתור אישור. לאחר מכן, הזז את הכלי המלבני סביב המושבות כדי לחתוך את החלק של הפלטה שמכיל את המושבות.

כשאתה מוכן, לחץ על אישור כדי להשלים את החיתוך. הגדר את הרשת המשמשת לציור אזור העניין, או ROI, סביב כל מושבה ומדידת אזור התנועה. בחרו את צפיפות המושבה המתאימה והתאימו את הפרמטרים לפי הצורך כדי להבטיח שכל מעגל ממוקם סביב המושבה.

כשאתה מוכן, הפעל את תיבת האישור ולחץ על כפתור האישור. אזור התנועתיות של כל מושבה יימדד, וקובץ CSV המכיל את הנתונים יישמר בתיקייה המיועדת. לבדיקת תנועתיות, יש להשתמש באוטוקלב בתמיסת אגר המכילה M9, גלוקוז, חומצות קסמינו ומגנזיום סולפט.

שפכו 25 מיליליטר של האגר המקורר והמעורבב לכל צלחת פטרי. לאחר מכן, החסן כל צלחת ב-2.5 מיקרוליטר של תרבית חיידקים במהלך הלילה ודוגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות כשהמכסים פונים כלפי מעלה כדי לצפות בפנוטיפים של תנועתיות. לאחר אוטוקלב תמיסה של LB עם 1% אגר, שפכו 25 מיליליטר מ-LB 1% אגר מקורר ומעורבב ללוחות פטרי.

דקור חיידקים מחוסנים בתחתית הלוחות המתכווצים המכילות 1% אגר. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות, ואז בטמפרטורת החדר למשך 48 שעות נוספות. לאחר הדגירה, הסר בזהירות את האגר מהצלחות.

דמיינו את אזור התנועה על ידי צביעת צלחת פטרי בתמיסת סגולת 1% קריסטל. בדיקת תנועתיות העווית הראתה כי מוטנטים של Pseudomonas aeruginosa עם מחיקות גנים של מכונות T4P הראו אזורי הילה קטנים משמעותית לעומת הסוג הבר, מה שמעיד על ירידה בתנועתיות העוויתות. ניתוח תנועתיות ה-Swarming גילה שמוטנטים של מחיקה בספריית PA14 הפחיתו משמעותית אזורי הילה ללא בליטה, מה שמאשר פגום ביכולת ההתקפות של הלהקה.

מחקרי תנועתיות חיידקים מוגבלים לעיתים קרובות על ידי קצב התפוקה שלהם. פרוטוקול התנועתיות בעל תפוקה גבוהה שלנו יסייע לחוקרים לחקור את תנועתיות החיידקים באופן מקיף. לדוגמה, באמצעות אוסף מוטנטים גנומי רחב, ניתן לזהות את כל הגנים הקשורים לתנועתיות ולחשוף כיצד חיידקים גורמים לזיהומים.

הממצאים שלנו מעלים שאלות חדשות לגבי שליטה גנטית בתנועתיות ב-Pseudomonas aeruginosa, תפקידה ביצירת ביופילם, והקשר שלה לפתוגנזה. הם גם מסייעים בחקר האופן שבו תנאי הסביבה מעצבים התנהגויות תנועתיות, והאם מיקוד בגנים לתנועתיות יכול להוביל לטיפולים אנטימיקרוביאליים חדשניים.