אופטימיזציה של אספקת שלפוחית חוץ-תאית באמצעות פיגום מודפס בתלת-ממד במעטפת ליבה לטיפול בפצעים כרוניים

היקף המחקר הוא לפתח עיצוב חבישת פצעים ביו-אקטיבי מתקדם לניהול יעיל של פצעים כרוניים. הפיגום יבטיח שליטה, פירוק ואספקה מקומית יעילה של שלפוחיות חוץ-תאיות.

הפרוטוקול הנוכחי נועד להתגבר על המגבלה של חבישת פצעים קונבנציונלית בניהול דלקת כרונית. בפרט, חוסר שליטה, השפלה ושחרור שלפוחית חוץ-תאית בזמן.

פרוטוקול זה מציע בגישה מכווננת לספק חומרים טיפוליים כולל גנים בזמן ליישומים שונים.

כל התוצאות מספקות תובנות חדשות לגבי התאמה אישית של פיגום לסוגי פצעים שונים ושיפור טיפולים רגנרטיביים על ידי העמסת שלפוחיות חוץ-תאיות במולקולות ביו-אקטיביות ספציפיות.

המעבדה שלנו עומדת לבנות פלטפורמת מחקר תרגומית לטיפול בריפוי פצעי סוכרת.

[קריין] כדי להתחיל, יש להפשיר במהירות בקבוקון של תאי גזע מזנכימליים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. הסר את הבקבוקון כאשר נותר שבר קרח קטן. העבירו את כל תכולת בקבוקון תאי הגזע המזנכימליים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל מדיום שלם. צנטריפוגה את התאים בטמפרטורה של 200 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא במיליליטר אחד של מדיום שלם טרום חם. לאחר מכן העבירו את התאים לבקבוק T25 המכיל ארבעה מיליליטר של מדיום שלם. הטה בעדינות את בקבוק T25 כדי להבטיח שהתאים מפוזרים באופן שווה. דגרו את הבקבוק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. כאשר התאים הגיעו למפגש של 70% עד 80%, שאפו את המדיום המושקע מבקבוק T25. הוסף שלושה מיליליטר PBS טרי לבקבוק כדי להסיר תאים שנותרו. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של תמיסת טריפסין 0.25% לבקבוק ודגירה. עקוב אחר ניתוק התאים תחת המיקרוסקופ בהגדלה פי 4. כעת הוסיפו ארבעה מיליליטר של מדיום שלם וחם מראש לבקבוק ופיפטה למעלה ולמטה על פני השטח לניתוק. לאחר מכן העבירו את מתלה התא לצנטריפוגה של 15 מיליליטר שתיים. לאחר הצנטריפוגה, השעו מחדש את כדור התא במדיום טרי ושלם וספרו את התאים. לאחר מכן העבירו את התאים לבקבוק T75 עם צפיפות זריעה של 5,000 תאים לסנטימטר מרובע. דגרו את בקבוק T75 ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר 72 שעות, אסוף את המדיום המותנה מהתאים לבידוד שלפוחית חוץ-תאית. כדי לבודד את השלפוחיות החוץ-תאיות או EVs, צנטריפוגה את 13 מיליליטר המדיה המותנית שנאספה ב-800 G למשך 15 דקות כדי להסיר פסולת סלולרית. השתמש במסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר כדי לסנן את הסופרנטנט ולהסיר חלקיקים גדולים. כעת הוסף חמישה מיליליטר של מאגר משקעים למדיה הממוזגת המסוננת. מערבלים היטב את התערובת כדי לוודא שהיא הומוגנית. דגרו את התערובת למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס כדי לאפשר לשלפוחיות חוץ-תאיות לשקע. לאחר מכן צנטריפוגה את התערובת בחום של 3,220 גרם למשך 30 דקות בחום של 20 מעלות צלזיוס. הקפדה על איזון הצינורות. השליכו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע שוב לכדור ולצנטריפוגה למשך חמש שניות. כעת תולה בעדינות את גלולת ה-EV ב-200 מיקרוליטר PBS כדי למנוע נזק לשלפוחית. בצע כתמים מערביים כדי לזהות סמנים ספציפיים לשלפוחית חוץ-תאית, כולל CD63, CD81 ו-CD9. הכינו תמיסת נתרן אלגינט טרייה של 4.5% במים סטריליים אולטרה-טהורים. ערבבו את התמיסה למשך הלילה בחום של 60 מעלות צלזיוס כדי להבטיח פירוק מוחלט. לאחר מכן, יש להמיס קרבוקסימתיל צלולוז במים סטריליים טהורים במיוחד כדי להשיג תמיסה של 3.8%. צנטריפוגה של דיו הביו המוכן ב-3,220 גרם למשך 10 דקות ב-25 מעלות צלזיוס כדי להסיר בועות שעלולות להפריע לתהליך ההדפסה. כעת השתמש במיקסר מזרק וערבב שלושה מיליליטר מתמיסת הנתרן אלגינט המוכנה עם EVs מסומנים או בקרת Dialymmi. מערבבים בעדינות היטב כדי להבטיח מתלה אחיד. השתמש במערבל מזרק אחר כדי לשלב מיליליטר אחד של קרבוקסימתיל צלולוז עם תמיסת אלגינט ליאז שהוכנה טרייה במים סטריליים אולטרה-טהורים כדי להשיג ריכוז סופי של 0.5 מילי-יחידות למיליליטר. טען בו-זמנית את הדיו הביולוגי נתרן אלגינט EV לחלק הליבה ואת הדיו הביולוגי של Carboxymethylcellulose alginate Lyase לחלק הנדן של מערך המזרק. הפעל את תוכנת מדפסת הביו התלת מימדית. בחר צורה גלילית עם דפוס מילוי אלכסוני כדי ליצור את מבנה הפיגום. הגדר את קוטר הצילינדר ל -20 מילימטרים ואת הגובה ל -1.1 מילימטרים. הגדר את גודל הנקבוביות למילימטר אחד. הגדר את מהירויות השאיבה של זרבובית הליבה והנדן למילימטר אחד לשנייה בעובי של 0.25 מילימטרים לשכבה. הגדר את מהירות התנועה לשישה מילימטרים לשנייה והדפס ארבע שכבות בטמפרטורת החדר. השתמש במכשיר אדים עם תרסיס סידן כלורי כדי לקשר את הפיגום במהלך תהליך האקסטרוזיה. התחל להדפיס את הפיגום על סרט פוליאסטר. מקם את פיית מכשיר האדים במרחק של כ-20 סנטימטרים מראש האקסטרוזיה כדי להבטיח קישור צולב יעיל. טבלו את הפיגום בתמיסת סידן כלורי 2.2% למשך 10 דקות כדי להשלים את הקישור הצולב. שטפו את הפיגום שלוש פעמים במים סטריליים טהורים במיוחד כדי להסיר עודפי סידן כלורי ודיו ביו לא קשור. לגלח את עור הגב על עכבר סוכרתי OCTA מורדם עם קוצץ חשמלי כדי להימנע מגירוי או פציעה בעור. כעת צור פצע עורי עגול בעובי מלא של שישה מילימטר על פני הגב של כל עכבר. הנח בעדינות את הפיגום המודפס בתלת מימד המכיל שלפוחיות חוץ-תאיות עם תווית PKH על מיטת הפצע. ודא שהפיגום מכסה במלואו את משטח הפצע ולחץ קלות עם מלקחיים סטריליים כדי למזער כיסי אוויר. העברת עכברים מורדמים למערכת ההדמיה IVIS לאחר שעתיים, ארבע שעות, שמונה שעות ו-24 שעות לאחר ההשתלה. באשף ההדמיה, בחר באפשרות ההדמיה הקרינה והפעל את מסנני העירור והפליטה עבור צבע ה-PKH. התאם את הגדרות המצלמה, כולל שדה הראייה וגובה הנושא כדי לייעל את זיהוי האות. התחל לרכוש תמונות, שמור את הנתונים שהתקבלו. לאחר מכן שחרר את האותות הפלואורסצנטיים מהרכבים החשמליים המסומנים במסומן. ה-EVs של אלגינט בפיגום אלגינט ליאז קרבוקסימתיל צלולוז הציגו פרופיל שחרור מהיר יותר בהשוואה ל-EVs של אלגינט רק בקרבוקסימתיל צלולוז, במיוחד בנקודות הזמן של שעתיים וארבע שעות.