הקמת מודול קוקולטורה תלת מימדי של תאי אפיתל באמצעות ממברנות ננו-סיביות

קבוצת המחקר שלנו משתמשת באלכוהול פולי ויניל, PVA ופולי אפסילון-קפרולקטון, PCL, ננו-סיביים כדי לפתח מערכת קוקולטורה תלת-ממדית. מטרתו לענות על האופן שבו הממברנות תומכות בתאי אפיתל ופיברובלסט, מחקים סביבות רקמה ולהקל על המחקר של איתותים דפוסים ואינטראקציות תאיות. אנו נראה כי ממברנות ננו-סיביות אלקטרו-סובביות נקבוביות מאפשרות לתאי אפיתל ליצור רקמת אפיתל, ומאפשרות רב-שכבתיות ופיברובלסטים לגדול בכל מטריצה נוספת.

השיטות מדגישות כיצד מערכת תלת-ממדית מורחבת יכולה לספק לרקמות גדלות סביבות טובות יותר בהשוואה לתרבויות מסורתיות עד דו-ממדיות. אנו מציעים מערכת קוקולטורה המשתמשת בתאי אפיתל ממוינים. ארגון באמצעות תאי גזע דורש הליך התמיינות מורכב, אך למודל שלנו יתרונות בפשטות ובחיסכון בזמן בפיתוח מערכת קוקולטורה תלת ממדית.

אנו מתמקדים בהתגברות על המגבלה של פיגומים ננו-סיביים על ידי שילוב של ממברנות ננו-סיביות עם הידרוג'לים שכבתיים יתר על המידה בתרבויות הקו-סיביות. כדי להתחיל, להוסיף 0.02 גרם של חומצה פוליאקרילית וגרם אחד של PVA לבקבוק זכוכית נקי המכיל מוט מגנטי. הוסיפו 7.8 מיליליטר מים מזוקקים לבקבוק, ולאחר מכן הניחו את הבקבוק על מערבל צלחת.

לאחר שהבקבוק מתקרר לטמפרטורת החדר, הוסיפו לו 0.2 מיליליטר גלוטראלדהיד והחזירו אותו למערבל הצלחת ב-500 סל"ד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש מזרק חמישה מיליליטר עבור אלקטרו ספינינג. הפרידו את הבוכנות מהחביות ונקו פסולת פלסטיק קטנה בתוך החביות ובקצות הבוכנות.

לאחר מכן, השתמש במחטים כדי לחסום את זרימת הנוזל ולשפוך את תמיסת PVA לתוך כל חבית מזרק. להרכיב את הבוכנות לתוך החביות ולהסיר את המחטים. לאחר הרכבת מחט מתכת חדשה בעלת 27 מדדים, הכנס אותה למכונת הטווייה האלקטרונית.

עטפו את הקולט היטב ברדיד אלומיניום. ברגע שלוח המזרק חוזר למקומו המקורי, כוונו את מכונת האלקטרו ספינינג לנפח הזרקה של שני מיליליטר, קצב הזרקה של שישה מיקרוליטר לדקה, מהירות גלגול של 100 סל"ד ומרחק קצה לאספן של 14 סנטימטרים. בדוק את זרימת הנוזל עבור כל משאבה, ולאחר מכן הפעל את מכונת הטווייה החשמלית עם פוטנציאל חשמלי של כ -12 קילו וולט.

לאחר השלמת תהליך האלקטרו ספינינג, נתקו את נייר הכסף המכיל את משטח הסיבים מהקולט. אחסנו את משטח הננו-סיבים בחומר ייבוש תחת ואקום. הוסיפו 1.5 גרם PCL ו-8.5 מיליליטר כלורופורם לבקבוק זכוכית נקי.

מניחים את הבקבוק על מערבל צלחת וממיסים את ה-PCL בכלורופורם למשך 12 שעות בטמפרטורת החדר. חותכים חתיכה קטנה של קרום ננופייבר, מצפים את החתיכות בשכבת זהב דקה באמצעות תהליך התזה אוטומטי במשך חמש דקות. כדי להתחיל, חתכו את משטח ננופייבר PVA המיוצר לחתיכות בגודל הרצוי עבור תוספת הטרנסוול.

הכינו מנה קטנה המכילה 1.5 מיליליטר של חומצה הידרוכלורית טהורה. מניחים את התבשיל עם חומצה הידרוכלורית ואת חתיכות ננופייבר בתוך תא ואקום ולסגור את המכסה. לאחר מכן פתח את השסתום המחובר למשאבת הוואקום והמתן 10 שניות עד שאדי חומצה הידרוכלורית יעלו.

סגור את השסתום וטפל בקרומים עם אדי חומצה הידרוכלורית במשך שתי דקות. לאחר הטיפול בחומצה הידרוכלורית, מוסיפים טיפות מים מזוקקים לממברנות. הניחו את הקרומים על מגלשת זכוכית והוציאו אותם מנייר הכסף.

השתמש בציפוי מרזב אוטומטי כדי לצפות את הממברנות על סרט פחמן בשכבה דקה של זהב. לאחר מכן שטפו את קרומי ננו PVA המקושרים שלוש פעמים עם חומצה הידרוכלורית עם PBS והשרו אותם במדיה התרבית. לאחר ההשרייה, לבדוק את ה- pH כדי לאשר את היעדר חומצה הידרוכלורית שיורית.

כדי להתחיל, חתכו את מחצלות הננו-סיבים לחתיכות עגולות בקוטר של 10 מילימטרים עבור ננו-ממברנות PVA ו-13 מילימטרים עבור ננו-ממברנות PCL. מערבבים את בסיס SYLGARD 184 ואת חומר הריפוי ביחס מסה של 10 לאחד בכוס פלסטיק. השתמשו במגלשת זכוכית נקייה כדי לערבב במרץ את תמיסת הפולידימתילסילוקסן, או תמיסת PDMS, במשך שתיים עד שלוש דקות עד להיווצרות בועות.

פזרו את PDMS באופן שווה על שקופית זכוכית. טבלו היטב את הקצה התחתון של התוספת לתוך ה-PDMS. לאחר מכן הניחו את העלון הפוך על המגלשה למשך 10 עד 15 דקות עד שה-PDMS יתקשה.

בדוק את PDMS עם קצה פיפטה 200 מיקרוליטר כדי לוודא שהוא כבר לא דביק. כעת, לחץ בעדינות על האינסרט היטב על חתיכת קרום ננו PVA, כך שתחתית האינסרט פונה היטב לצד הננו-סיבי של הממברנה. מוסיפים טיפת מים מזוקקים למרכז הבאר ומשתמשים במלקחיים כדי להסיר בזהירות את נייר הכסף.

לאחר מכן מניחים את הכנס היטב לתוך צלחת חדשה 24 באר ולאפשר לקרום להתייבש. בעת חיבור חתיכת ננו ממברנה, טובלים קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר בתערובת PDMS ומנקדים אותו בדיוק בארבע הפינות ובמרכז הבאר. הניחו את הצלחת על המגלשה חם יותר ואפשרו ל-PDMS להתקשות במשך חמש עד שבע דקות.

לאחר מכן, הניחו את פיסת קרום הננו PCL לתוך PDMS המכיל היטב עם צד ננו-סיבים מחובר PDMS. השתמשו במברשת קטנה ונקייה כדי ללחוץ מעט על צד נייר הכסף של הממברנה לחיבור מלא. לאחר מכן להוסיף 0.2 מיליליטר של 70% אתנול לבאר כדי להקל על הסרת נייר כסף.

יש לעקר היטב את האינסרט ואת החלק התחתון במערך הטרנסוול תחת אור אולטרה סגול למשך הלילה. למחרת, שטפו היטב את האינסרט ואת התחתית על ידי הוספת 200 מיקרוליטר PBS לאינסרט ו-500 מיקרוליטר לבאר התחתונה למשך שלושה מחזורים של 10 דקות כל אחד. ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 70% עד 80%, שטפו אותם עם 10 מיליליטר של PBS והוסיפו שני מיליליטר של 0.05% טריפסין EDTA כדי לטריפסין אותם.

הקש על הצלחת בעדינות כדי לעקור את התאים מלמטה. הוסף שמונה מיליליטר של מדיה תרבית מלאה כדי לנטרל את אנזים הטריפסין, ולאחר מכן להעביר את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור ב 400G במשך חמש דקות.

לאחר השלכת הסופרה נטנט, השהה מחדש את גלולת התא בחמישה מיליליטר של DMEM מלא עם מדיה F12. לאחר מכן מלא את החלק התחתון היטב עם 500 מיקרוליטר של מדיה מלאה DMEM F12. העבירו את הקרום הננו-סיבי PVA המחובר לטרנסוול והוסיפו 50 מיקרוליטר של תרחיף תאי MLE-12.

לאחר מכן, מלא היטב את הקרום הננו-סיבי PCL המחובר למטה עם 500 מיקרוליטר של השעיית תאי NIH3T3. לאחר דגירה של התאים במשך שעתיים, הרכיבו את תא MLE-12 המכיל אינסרט ואת תא NIH3T3 המכיל באר תחתונה במערך הטרנסוול, ניתן היה להבחין בבירור בהתפלגות המרחבית של תאי NIH3T3 ותאי MLE-12 במערכת החקלאות המשותפת, כאשר תאי NIH3T3 ירוקים התפזרו בעומקים משתנים ותאי MLE-12 אדומים יצרו שכבות. תאי NIH3T3 חודרים לקרום הננו-סיבי PCL ונמתחים לאורך צירי הננו-סיבים, בעוד שתאי MLE-12 נצמדים לפני השטח של הממברנה הננו-סיבית-PDA ומציגים צבירה.