חילוץ מודול הצעירים של ממברנות הבסיס הריאתיות של עכברים מקומיים ממפות כוח הנגזרות ממיקרוסקופ כוח אטומי

במחקר שלנו אנו חוקרים את השפעת התכונות המכניות של המטריצה החוץ-תאית על התנהגות התא ושלמות הרקמה. אנו רוצים להבין כיצד יחסי הגומלין בין תאים למיקרו-סביבה שלהם משפיעים על תהליכים פתולוגיים כמו היווצרות גרורות. על ידי כריית נתונים של התכונות המכניות של קרום הבסיס הריאתי גילינו כי ממברנות בסיס רכות יותר עמידות יותר בפני פלישת תאים סרטניים.

השיטה המוצגת בפרוטוקול שלנו מאפשרת הקפאה וחקירה מכנית של דגימות ביולוגיות לא קבועות, מה שמשמר את התכונות המכניות. יתר על כן, הוא מראה דרך לקבוע את מודול יאנג אך ורק של קרום הבסיס בתוך הדופן המכתשית על ידי מדידה וסינון של מיקרוסקופ כוח אטומי המתוארים בפרוטוקול שלנו. השלב הבא הוא ללמוד עוד על הדינמיקה של נוקשות קרום הבסיס ותפקידה בתהליכים התפתחותיים ופתולוגיים כדי לשפר את האבחון ולהנחות את אפשרויות הטיפול.

כדי להתחיל, הסר את התבנית המכילה את טמפרטורת החיתוך האופטימלית הקפואה, או OCT, רקמות ריאה משובצות של עכבר מהמקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס. הנח סרט דבק דו צדדי במרכז שקופית המיקרוסקופ בקצה החלבי. גלגל צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר על הסרט כדי להבטיח הידבקות יציבה ונטולת בועות.

ודא שאורך הסרט תואם את רוחב בלוק ה-OCT המכיל את הדגימה. סמן את השקופיות בעיפרון, כולל המידע לדוגמה ומספרי הסעיפים. הכנס את שקופיות המיקרוסקופ המוכנות לקופסת שקופיות.

הנח את קופסת ההחלקה בתוך תא הקריוטום כדי לצנן את המגלשות. לאחר מכן, מלאו את שתי הטבעות הפנימיות של מחזיק הדגימה במדיום OCT. מקם את המדגם בתוך מדיום ה-OCT על מחזיק המדגם.

הנח את מחזיק הדגימה בתא הקריוטום למשך כ-10 דקות עד שמדיום ה-OCT מתמצק לחלוטין והדגימה מאובטחת היטב. כעת, התקן את מחזיק המדגם על שלב החיתוך של הקריוטומה. חבר חתיכת סרט דבק חד צדדי לדגימה על ידי לחיצה חזקה עם אגודל קריר.

לייצר קטע רקמה של 15 מיקרומטר באמצעות הקריוטום. השתמש במברשת כדי לכוון את החלק ולמנוע את ניתוק סרט ההדבקה במהלך הליך החיתוך. השתמש בשקופית מיקרוסקופ צוננת עם סרט דבק דו צדדי ולחץ אותה בחוזקה על החלק כדי להרים אותו.

הנח את השקופית הנושאת את החלק בחזרה לתוך קופסת השקופיות. כדי לכייל את השלוחה בשיטת הרעש התרמי, הנח שקופית מיקרוסקופ על שלב הדגימה של מיקרוסקופ הכוח האטומי, או AFM. הנח את ראש ה-AFM על הדוגמהtagה.

לאחר מכן הורד את ראש ה-AFM באמצעות מנועי הצעד עד שהפער בין מחזיק השלוחה לשקופית המיקרוסקופ הוא כמילימטר עד שניים. בעזרת מזרק של מיליליטר אחד עם מחט ארוכה מרחו PBS על הצד של מחזיק השלוחה, ואפשרו לו לזרום למטה וליצור מניסקוס נוזלי בפער. בתוכנת בקרת AFM כדי לבצע כיול מבוסס מגע, נווט אל הדף Acquire Data ובחר באפשרות Advanced View.

גש למנהל הכיול על ידי לחיצה על כפתור תפריט ההמבורגר הממוקם בפינה השמאלית העליונה. לאחר מכן בחר מבוסס איש קשר כשיטה, ושלוחה MLCT-F מהתפריט הנפתח שם כשם השלוחה. הזן וולט אחד בשדה Setpoint ו-10 בשדה מספר סריקות.

בדף רכישת נתונים הזן נקודת הגדרה של וולט אחד עבור הליך הגישה האוטומטית בלוח הבקרה השמאלי. לחץ על לחצן החץ הכחול המצביע כלפי מטה בפינה השמאלית העליונה של הממשק כדי להתחיל את הגישה האוטומטית. לאחר השלמת הגישה והשלוחה נמצאת במגע עם שקופית המיקרוסקופ, לחץ על כפתור כיול בחלון מנהל הכיול כדי להתחיל בכיול.

לאחר השלמת הכיול, סגור את חלון מנהל הכיול וודא שנוצר כיול file בספרייה שנבחרה מראש המכילה את תוצאות הכיול שנקבעו. כדי להתחיל, שלף את שקופית הדגימה המכילה רקמות ריאה של עכבר חתוכות מהמקפיא. הנח את שקופית המיקרוסקופ על הדגימהtagה של ה-AFM.

לחץ על הכפתור עם סמל מפתח הברגים בפינה השמאלית העליונה של ממשק המשתמש כדי לנווט אל מנהל ההגדרות. בסעיף הגדרות גישה, הגדר את גובה היעד לארבעה מיקרומטרים. לאחר מכן, בקטע הגדרות מצב נוכחי תחת הגדרות משוב מתקדמות, הגדר את המכפיל לאחד.

בסעיף המשנה Force Settings של הגדרות המצב הנוכחי, בחר Retracted Piezo מהתפריט הנפתח Mode at end. בלוח הבקרה השמאלי, הגדר את הפרמטרים עבור עקומות כניסת הכוח. עבור ה-NanoWizard 4 XP ושלוחת ה-MLCT F הזינו Setpoint לחמישה ננו-ניוטון, אורך Z לשמונה מיקרומטר ומהירות Z ל-300 מיקרומטר לשנייה.

לאחר מכן, הגדר את המיקום והגודל של מפת כוח הסקירה הראשונית כך שתקיף את כל הדופן המכתשית, המשתרעת מצד אוויר אחד למשנהו. הגדר את מספר הפיקסלים ל- 50 על 50. לאחר הקלטת מפת הסקירה, צלם מפת כוח ממוקדת יותר בגודל של שלושה על שלושה מיקרומטר או ארבעה על ארבעה מיקרומטר על קרום המרתף, תוך שמירה על מספר הפיקסלים על 50 על 50 עקומות.

כדי לנתח עקומות כניסת כוח, הפעל את ארגז הכלים לעיבוד CANTER ב-MATLAB ופתח את אפליקציית ניתוח עקומת הכוח. לאחר מכן כדי לטעון את מפת הכוח ברזולוציה גבוהה של קטע הריאות לחץ על בחר קובץ, נווט למיקום השמירה, לחץ פעמיים על הקובץ ובחר טען נתונים. כאשר מופיע החלון המוקפץ המבקש ערכי כיול עבור השלוחה, הזן את ערכי הכיול בשדות העריכה המתאימים.

לחץ על כפתור שלח כדי להמשיך. בחלון מוקפץ שני המשך בהליך הטעינה של מפת ההדמיה הכמותית, או QI, על ידי לחיצה על כפתור שלח. עם השלמת תהליך הטעינה, עקומת הכוח הראשונית של מפת הכוח מוצגת על המסך.

הגדר את עומק ההתאמה בשדה העריכה המתאים ל-1.5 מיקרומטר ובחר באמצעות התאמת הרץ עבור אלגוריתם איתור המגעים. כדי להחיל את ההתאמה של מודל הרץ שהשתנה על כל עקומות כניסת הכוח של מפת QI, לחץ על הלחצן שמור החל על הכל. לאחר השלמת ניתוח עקומת הכוח האחרון, מופיע חלון לשמירת הקבצים.

לחץ על כן והזן שם עבור קבצי התוצאות. לסינון מרחבי של מפת QI מחלון בחירת היישום בארגז הכלים לעיבוד CANTER, בחר בכלי סינון התוצאות ולחץ על כפתור התחל יישום. כדי לטעון את תוצאות ההתאמה לחץ על פתח בשורת התפריטים העליונה של ממשק המשתמש של כלי סינון התוצאות.

בחלון המוקפץ הבא, אתר את כפתור ההגדרה הראשון תחת הכרטיסייה JPK Maps ובחר את קובץ ה-tsv המכיל את תוצאות ניתוח עקומת הכוח. לאחר מכן לחץ על כפתור הסט השני ואתר את קובץ מפת ה-QI המתאים לקובץ ה-tsv שנבחר. לאחר מכן, לחץ על שלח כדי לטעון את נתוני המפה ואת תוצאות ניתוח עקומת הכוח.

מהתפריט הנפתח ערוץ מוצג בחלק העליון בחר באפשרות EModul כדי להציג את תוצאות המודול של יאנג כתמונת מפה. לאחר מכן, מהתפריט הנפתח ערוץ נתונים מתחת לתרשים ההיסטוגרמה, בחר באפשרות EModul כדי לדמיין את התפלגות ערכי המודול של יאנג הטעונים של מפת ה-QI. לאחר מכן, לחץ על כפתור חץ זרימת המניפולציה במרכז ממשק המשתמש, וודא שהוא מצביע לכיוון צד ימין.

הגדר את הלחצן הדו-מצבי של מסנן התמונה למיקום On בחלונית Filter מעל צירי ההיסטוגרמה. מהתפריט הנפתח סינון גיאומטריה בחר באפשרות Freehand ולאחר מכן לחץ על כפתור הוסף. בתמונת הערוץ העליון, ציירו את מסיכת המסנן על ידי סיבוב קרום הבסיס תוך החזקת לחצן העכבר השמאלי.

לאחר מכן שחרר את לחצן העכבר בסיום ולחץ פעמיים על המסכה כדי להחיל אותה על המפה. כדי לשמור קובץ תוצאות tsv חדש עם ערכי המודול של יאנג במסכה, לחץ על שמור, שמור היסטוגרמה ושמור נתונים בשורת התפריטים העליונה. בחלון המוקפץ שמופיע, לחץ על בחר הכל כדי לבחור אילו תוצאות לכתוב לקובץ ה-tsv.

לאחר מכן לחץ על OK כפתור כדי לאשר את הבחירה. בתיבת הדו-שיח Save, הזן שם לקובץ tsv, בחר את מיקום השמירה הרצוי ולחץ על OK כדי לשמור את התוצאות המסוננות. ערכי המודול של יאנג של קרום הבסיס הריאתי הציגו התפלגות נורמלית לוג עם ערך שיא של 9.31 וסטיית תקן של 0.18, מה שהניב מודול יאנג מייצג של 11.05 קילופסקל.

ממצאים אלה אושרו עוד יותר על ידי תרשים קוונטילי-קוונטילי.