יצירת ספרואידים/אורגנואידים תלת מימדיים מתרביות תאים דו-ממדיות באמצעות מכשיר חותמת חדשני

היקף המחקר שלנו הוא לבסס פרוטוקול יעיל וניתן לשחזור ליצירת תרביות תאים תלת מימדיות באמצעות מערכת מיקרו-באר חדשנית מבוססת צעד בתבניות אגרוז. אנו שואפים לענות כיצד ליצור סביבה פשוטה ומבוקרת המקדמת תרביות תלת מימד אחידות ואיכותיות לבדיקת תרופות, הנדסת גנים ויישומים קשורים. ההתקדמות האחרונה במערכות תרבית תאים תלת מימדית משפרת את האינטראקציות בין התאים ויוצרת יותר בסביבות דמויות vivo.

גישה זו משפרת את היווצרות האורגנואידים הספרואידים, מה שהופך אותה לכלי מבטיח למחקר ביו-רפואי. הטכנולוגיות הנוכחיות לתרבית תאים תלת מימדית כוללות טיפות תלויות, תרבית תאים מסתובבת, פלסטיק עם חיבור נמוך, צלחות עם בארות חרוטיות, פיגומים מיקרו-נקבוביים, חרוזים מגנטיים והידרוג'לים ללא פיגומים. שיטות אלו מאפשרות יצירת מבני תאים תלת מימדיים, שלכל אחד מהם יתרונות ומגבלות משלו.

הפרוטוקול שלנו מתמודד עם האתגר של יצירת ספרואידים ואורגנואידים תלת-ממדיים אחידים עם גודל ואיכות עקביים בקנה מידה גדול. הוא פותר בעיות של כדאיות וצפיפות תאים, טיפול בקשיים וחוסר יציבות במהלך התהליך, ומוכיח פתרון חסכוני וניתן לשחזור למחקר אמין של תרביות תאים תלת מימדיות. אנו מחויבים לשאוף לשיפור בכלי המחקר, יצירת אורגנואידים ספרואידים של תאי בטא המייצרים אינסולין לאנליזה חוץ גופית ואנקפסולציה בביופולימרים, במטרה להחזיר סוכרת מסוג 1 וליצור אורגנואידים ספרואידים מתאי סרטן שד אנושיים טריפל נגטיב כפלטפורמה לסריקת תרופות לפני הטיפול בחולה.

תכנן את מכשיר החותמת באמצעות התוכנה שצוינה. שטפו את החותמת בהתאמה אישית עם ספוג זיפים רך ומים מזוקקים כדי להסיר שאריות. חשוף את החותמת הנקייה לאור אולטרה סגול למשך חמש עד 10 דקות כדי להבטיח סטריליות.

להכנת תמיסת אגרוז של 1 עד 2%, שקלו את הכמות הנדרשת של אבקת אגרוז טהורה והמיסו אותה ב- PBS. מחממים את התמיסה במיקרוגל עד להמסה מלאה של האגרוז. לאחר מכן, פיפטה כשלושה מיליליטר מתמיסת אגרוז של 40 מעלות צלזיוס לכל באר של צלחת בת שש בארות.

מניחים את החותמת במרכז הבאר ומניחים לאגרוז להתמצק במשך 5 עד 10 דקות. לאחר ההתמצקות, הסר את החותמת בתנועות עדינות קדימה ואחורה כדי לשחרר את הוואקום מבלי לפגוע במיקרו-בארות. שטפו את המיקרו-בארות שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר שאריות.

חשוף את הצלחת לאור אולטרה סגול למשך 10 דקות כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי. הוסף שלושה מיליליטר של מדיום תרבית לכל באר מצלחת שש הבארות ודגר את הצלחת למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס בחממת פחמן דו חמצני. כדי להשיג תרחיף הומוגני של איי לבלב חזירים, הוסף טריפסין לתרבית תאים דו-ממדית כדי לנתק את התאים.

לאחר מכן, ספרו את התאים והתאימו את הריכוז כדי להשיג את מספר התאים הרצוי למיקרו-באר של צלחת בת שש בארות. פיפטה שלושה מיליליטר של תרחיף התא מעל בארות המיקרו של האגרוז וסובב את הצלחת כדי להבטיח פיזור אחיד. אפשר לתאים להתיישב בכוח הכבידה למשך 10 עד 15 דקות.

לאחר מכן, התבוננו בתאים המיושבים תחת המיקרוסקופ. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני של 5%. כל יומיים-שלושה, החלף 50% מהמדיום הישן או המושקע במדיום טרי.

המשך בתרבות עד להיווצרות מבנים קומפקטיים ותלת מימדיים במלואם. כדי לאסוף ספרואידים או אורגנואידים, הסר את מדיום התרבית ובעזרת קצה פיפטה חתוך, אסוף את המבנים התלת מימדיים באמצעות פיפטינג נמרץ. מבנים תלת מימדיים קומפקטיים נוצרו בהצלחה על ידי 48 שעות של תרבית במיקרו-בארות אגרוז כפי שנצפה באמצעות צבירת תאים תלוית זמן.

מבנים תלת מימדיים ברי קיימא נשמרו עם הסרתם ממיקרו-בארות אגרוז עם צביעה ירוקה המצביעה על תאים חיים בתוך המבנים, המאשרת את כדאיות התא ויציבותו.