הקפאה ישירה של ראשי דרוזופילה לצביעה פלואורסצנטית משופרת של המוח וצביעה חיסונית

הצוות שלנו חוקר הפרעות מטבוליות, לבביות, שנת שרירים והזדקנות באמצעות מודל דרוזופילה. מאמר זה של Jove פירט פרוטוקול פשוט לעיבוד רקמות מוח, כולל עריפת ראש, קיבוע, הקפאה, צביעה והדמיה. קבוצת המחקר שלי הייתה חלוצה בפיתוח מודל דרוזופילה כדי לחקור כמה מחלות אנושיות והזדקנות.

חקרנו גם התערבויות כמו האכלה מוגבלת בזמן ופעילות גופנית. אנו משתמשים בלמידת מכונה, אומיקס וגישה מולקולרית כדי לחקור גורמים כמו שעון ביולוגי וגנטיקה כדי לחשוף את השפעתם על שלמות התא, הפיזיולוגיה וההתנהגות. פרוטוקול מחקר מוח פשוט זה נמנע מנתיחות מורכבות, דורש ביצוע ביד אחת בלבד, ומבטל את הצורך במיקרוסקופיה קונפוקלית יקרה, מגביר את הנגישות ומפחית את התלות בציוד.

כדי להתחיל, השיגו את הזבובים בבקבוקונים מזדקנים, ואז פתחו את השסתום על מחצלת הפחמן הדו חמצני, והשליכו במהירות את הזבובים על המחצלת כדי למנוע בריחה. ברגע שהזבובים מאבדים את ההכרה ברובם, מקמו את הזבובים מתחת למיקרוסקופ SZ61 על ידי הזזת המחצלת מתחת לעדשת האובייקט. כוונן את ההגדלה והמיקוד עד שהזבובים נראים בבירור ונוחים לעריפת ראש.

בעזרת מספריים קפיציים, מקם את הלהבים בין בית החזה לראש הזבוב ולחץ בחוזקה כדי לערוף את ראשיהם של חמישה עד 10 ראשי זבובים לכל קבוצת ניסוי. הניחו כל זבוב משומש בחזרה לבקבוקון ההזדקנות שלהם. בעזרת מברשת, העבירו בעדינות את ראשי הזבוב הכרותים לצינורות מסומנים של 1.5 מיליליטר המונחים על קרח.

לאחר הוצאת הצינורות מהקרח, פיפטה 100 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד ו-PBS לכל צינור כדי להבטיח שכל ראשי הזבובים שקועים במלואם. אם ראשים נדבקים לדפנות הצינור, דחף אותם בעדינות כלפי מטה באמצעות מברשת או הקש קלות על הצינור על משטח אופקי כדי להבטיח מגע נכון עם התמיסה. לאחר מכן דגרו את הצינורות למשך 15 דקות על שייקר אורביטלי במצב בינוני.

השליכו את תמיסת הפרפורמלדהיד והחליפו אותה ב-PBS, וודא שכל ראשי הזבובים שקועים. לאחר הכביסה האחרונה, העבירו את ראשי הזבוב לתמיסת סוכרוז של 10% ב-PBS, וודא שהם שקועים בתוך הצינור. מלאו תבנית מסומנת בקיבולת של כ-50% עם טמפרטורת חיתוך אופטימלית או תרכובת OCT, מה שמאפשר לה להתפשט לכל ארבע פינות התבנית.

בעזרת מברשת, הניחו בזהירות את ראשי הזבוב הקבועים שנאספו על פני תרכובת ה-OCT בתוך התבנית. בעזרת קצה המלקחיים, דחפו בעדינות כל ראש לתחתית התבנית, וודאו שהעיניים מכוונות כלפי מטה לחתך במישור העטרה. יישר בזהירות את כל הראשים במידות X, Y ו-Z כדי להבטיח שכל החלקים יכילו את כל קבוצות הניסוי בו זמנית.

לאחר יישור הראשים כראוי, הניחו בזהירות את התבניות ישירות למקפיא המוגדר במינוס 20 מעלות צלזיוס להקפאה. לאחר שהתבנית קפאה ברובה, מלאו את החלל שנותר בתרכובת OCT. לצורך הקפאת עובש, מרחו כמות נדיבה של תרכובת OCT על החלק העליון של התבנית כדי לחבר את סיבית הצ'אק לתבנית.

הניחו את הביט שטוח למעלה ותנו לו לקפוא לחלוטין בתוך הקריוסטט, מה שלוקח בדרך כלל חמש דקות. לאחר מכן שחרר את הביט ואת בלוק ה-OCT מהתבנית. הנח את הבלוק לתוך הצ'אק, וודא שהכיוון הנכון מלמעלה למטה נשמר והדק את מפתח הצ'אק עד שהבלוק נמצא היטב במקומו.

בעזרת כפתורי הכוונון ובקרות עומק הצ'אק, יישר את הבלוק עם הלהב. הגדר את רוחב החתך בקריוסטט ל-20 מיקרומטר וחתוך כל פרוסה בתנועה איטית ועקבית תוך מתן אפשרות לזכוכית נגד גלגול ללכוד כל פרוסה. לאחר מכן לכוד את החלקים באמצעות שקופיות חמות על ידי נגיעה בשקופית לקצה הקרוב יותר של הקטע ומתן אפשרות לחלק לעלות אל השקופית.

הניחו לשקופיות להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות, אך לא יותר משעה. קח את ראשי הזבוב של דרוזופילה בהקפאה והשתמש בסכין גילוח כדי להסיר כל תרכובת OCT שנותרה בשולי המגלשה, והשאיר מקום לגבול הידרופובי. לאחר מכן השתמש בטוש הידרופובי כדי לצייר גבול סביב כל שקופית ולאפשר לה להתייבש במשך חמש דקות.

שטפו את כל השקופיות שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחת באמצעות PBS על ידי פיפטינג עדין על המגלשה. לאחר שטיפת השקופיות, פיפטה 3%BSA בתמיסת חסימת מלח Tris Buffered על המגלשות ודגירה למשך 30 דקות עד שעה. לאחר מכן השליכו את תמיסת החסימה והעבירו את תמיסת הנוגדנים העיקרית על השקופיות.

דגרו את הנוגדן למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס או למשך שעה בטמפרטורת החדר באמצעות מגבונים לחים למניעת התייבשות. השליכו את תמיסת הנוגדנים העיקרית ושטפו את השקופיות שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת באמצעות PBS. לאחר מכן הוסיפו את תמיסת הנוגדנים המשנית לשקופיות ודגרו למשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר שטיפת השקופיות שלוש פעמים עם PBS, השאר רק כמות קטנה של PBS על השקופית. לאחר מכן, בעזרת פיפטה של 1000 מיקרוליטר, הוסף שלוש עד חמש טיפות של מדיית הרכבה מתקשה המכילה DAPI באופן שווה על פני השקופית. הנח החלקת כיסוי על המגלשה וודא שלא ייווצרו בועות אוויר במהלך המיקום.

טפל בזהירות בשקופיות הטריות שהותקנו ואחסן אותן שטוחות עד שאמצעי ההרכבה יבש לחלוטין. אם יש צורך באחסון לטווח הארוך, אטום את שולי המגלשות. צלם תמונות של השקופיות בהקדם האפשרי כדי למזער דעיכה פלואורסצנטית.

במהלך רכישת תמונה, התמקד בכל נושא ייחודי באותו ערוץ לעקביות בכל קבוצות הניסוי. כייל את החשיפות עבור כל ערוץ כדי למנוע חשיפת יתר בכל הערוצים שנבחרו. ודא שהחשיפות שנבחרו נשארות קבועות ומתאימות לכל הנבדקים, במיוחד בין קבוצות ניסוי שונות.

הביטוי של תג הנוגדן ApoE היה ממוקם בבירור באזורי המוח של דגימות Elav+ו-Elav-ApoE4. הצטברות שומנים צוינה על ידי צביעה אדומה של הנילוס, שנראית באזורי המוח בשני הגנוטיפים.