אניזוטרופיה פלואורסצנטית שנפתרה בזמן ממולקולות בודדות לאפיון גמישות מקומית בביו-מולקולות

מחקר זה נועד לחקור את הגמישות והדינמיקה המקומית של ביומולקולות ברמת המולקולה הבודדת, תוך שימוש באניזוטרופיה פלואורסצנטית שנפתרה בזמן במצב מיקרוסקופיה קונפוקלית. זיהוי ולוקליזציה של מולקולות בודדות אפשרו התבוננות בביו-מולקולות, אך לכידת הדינמיקה שלהן דורשת גישות אחרות. שיטות פלואורסצנטיות שנפתרו בזמן עוזרות למלא את הפער הזה.

כלים נפוצים לחקר ניסיוני של דינמיקה ביו-מולקולרית כולל מולקולה בודדת ו-NMR. ברמת המולקולה הבודדת, ניתוחים שונים, תהליכים, הפוטון על ידי פליטת פלואורסצנט פוטון, אלה כוללים ניתוח שנפתר בזמן וניתוח שונות פרץ.

שימוש במספר פלואורופורים לניסויי smFRET יכול להציג מורכבויות בתכנון הניסוי וביצירת דגימות באיכות טובה מספיק. שימוש בתווית אחת ובאניזוטרופיה פלואורסצנטית פותר חלק מהמורכבויות הללו.

מצאנו כי הצורה המונומרית של תחום ראש המזלג של ה-FoxP1 האנושי מתנהגת כחלבון לא מסודר ומגדילה את אוכלוסיית הקיפול שלו כאשר היא מתעמעמת.

[מדריך] כדי להתחיל, סנן את תמיסת החיץ הסטנדרטית המוכנה דרך מסנן בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן סנן את המאגר הסטנדרטי דרך מסנן פחם לרכישת מולקולה בודדת. עבור הבדיקות הפלואורסצנטיות, הכינו כמויות בנפח קטן של ה-BODIPY Fluorescent Pro המוכן. לכיול ההגדרה שנפתרה בקיטוב, ראשית, הפעל את ערוצי הגלאי המקבילים והניצבים והפעל את הלייזר הכחול. ודא שעוצמת הלייזר מוגדרת ל-60 מיקרו-וואט ופתח את לוח הבקרה של ספירת הפוטונים הבודדים או תוכנת TCSPC בקורלציה לזמן. לאחר מכן מערבבים מיקרוליטר אחד של 100 ננו-מולרי רודמין 110 עם 49 מיקרוליטר מים מזוקקים. הוסף טיפה של נוזל טבילה על גבי עדשת האובייקט של המיקרוסקופ. הנח את זכוכית הכיסוי על מטרת המיקרוסקופ וודא שטיפות המים מרוכזות על העדשה. הוסף 50 מיקרוליטר מתמיסת רודמין 110 המדוללת למרכז זכוכית הכיסוי למדידות כיול. כוונן את מישור התמונה כך שיהיה בתוך התמיסה ומעל משטח הזכוכית. באמצעות כפתור המיקוד, אתר את נקודת המוקד הבהירה השנייה והתאם אותה ל-1 1/2 סיבובים. כעת פתח את התוכנה במצב Time-Tagged Time-Resolved ולחץ על כפתור START. רשום את קצב הספירה למשך 120 שניות. למדידות רקע, הוסף 50 מיקרוליטר מים מזוקקים למרכז זכוכית הכיסוי וחזור על הרכישה. רשום את קצב ספירת הפוטונים למשך 300 שניות ושמור את הקובץ כ-water.ptu. למדידות רקע נוספות, הוסף 50 מיקרוליטר של חיץ סטנדרטי למרכז זכוכית הכיסוי. רשום את קצב ספירת הפוטונים למשך 300 שניות ושמור את הקובץ כ-standard_buffer.ptu. כעת הפעל את תוכנת הניתוח Burst Integration Fluorescence Lifetime, BIFL, ולחץ על אשר את ההגדרה מהחלון האוטומטי. לאחר מכן, לחצו על 'קבל פרמטרים מקובץ', ואחר כך לחצו על 'אישור'. לבחירת המדידה לניתוח, לחץ על מערך נתיב נתונים ובחר את מערך הנתונים המתאים. כעת טען את קובץ מדידת המים water.ptu עבור מערכים, כגון פיזור ירוק, הקובץ standard_buffer.ptu עבור הרקע הירוק ו- Rhodamine110.ptu עבור עבה ירוק. תחת פרמטרי הבחירה של מולקולה בודדת, לחץ על הבא ולאחר מכן התאם כדי לפתוח חלון קופץ חדש. לאחר מכן לחץ על סף כדי לשנות את זמן ההגעה הבין-פוטוני ולבחור זמן אירוע של מולקולה בודדת עבור זמן ההגעה הבין-פוטוני הממוצע. כעת לחץ על מספר מינימלי כדי להגדיר את המספר המינימלי של פוטונים לכל אירוע מולקולה בודדת. לאחר מכן סגור את החלון המוקפץ על ידי לחיצה על Return ו-OK. לחץ על פרמטרי Color Fit כדי להתאים את אורך החיים הקרינה הראשוני עבור ירוק וצבעים אחרים באמצעות פרמטרים של דעיכת הקרינה. שנה, הצג בקשה והשהה של ערכים על-ידי התאמת ערכי 'מאת' ו'אל' וסגירת החלון המוקפץ. לבסוף, לחץ להציל כדי לעבד את קבצי ASCII ולשמור אותם בתיקיה שנבחרה. העבירו חיסון מקדים למשך הלילה של Escherichia coli C41 ל-500 מיליליטר של מדיום LB עם אנטיביוטיקה נוספת מראש ביחס דילול של 1:500. מדוד את ספיגת התרבית ב-600 ננומטר כדי לעקוב אחר צמיחת התרבית. כאשר הצפיפות האופטית מגיעה בין 0.5 ל-0.7, הוסף IPTG לריכוז סופי של 0.5 מילי-מולר כדי לגרום לביטוי חלבון, ודגירה. צנטריפוגה של תאי החיידקים ב-3,000 גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס כאשר התרבית מגיעה לצפיפות אופטית של 1.4 עד 1.6. לאחר השלכת הסופרנטנט, יש לאחסן את הכדור במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש. לאחר מכן, הוסיפו 50 עד 100 חלבון FoxP1 מיקרו-מולרי לעודף מולרי פי עשרה של DTT או TCEP ודגרו. הנח עמוד התפלה PD-10 לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר באמצעות מתאם עמודה להחלפת חיץ. הוסף חמישה מיליליטר של מאגר PBS לעמודה לשיווי משקל וצנטריפוגה ב -1,000 גרם למשך שתי דקות. העבירו את עמודת ה-PD-10 לתוך צינור טרי של 50 מיליליטר, והוסיפו שני מיליליטר של מאגר PBS לעמודה. כעת טען 500 מיקרוליטר של חלבון FoxP1 לעמודה. יש לחסל את העמודה על ידי צנטריפוגה ב-1,000 גרם למשך שתי דקות כדי לאסוף את החלבון המטוהר. העבירו את החלבון למסנן אולטרה צנטריפוגלי במשקל מולקולרי של 10 קילודלטון. לאחר צנטריפוגה בחום של 7,500 גרם למשך 10 דקות, אוספים את הפליטה המרוכזת. מדוד את ריכוז החלבון. לאחר מכן מוסיפים BODIPY ודוגרים בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים על מסובב. חזור על חילופי חיץ וריכוז חלבון. לאחר קביעת ריכוז החלבון, מדוד את מידת התיוג באמצעות הנוסחה. הוסף 495 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד וחמישה מיקרוליטר של Tween 20 לבאר של מגלשת תא, וערבב היטב. לאחר דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר, שטפו את החדר בעדינות במים טהורים במיוחד פעמיים וייבשו אותו. כדי לתקן פלואורסצנטיות ברקע, בצע מדידות של תמיסת חיץ. כיול את הרגישות היחסית של הגלאים המקבילים והניצבים על ידי רכישת נתונים מצבע המסתובב במהירות עבור ניסויי אניזוטרופיה פלואורסצנטיים של מולקולה אחת על FoxP1 מונומרי, הוסף 100 BODIPY פיקומולרי המסומן FoxP1 ו-100 ננו טוחנת ללא תווית FoxP1 ל-500 מיקרוליטר של מאגר סטנדרטי בשקופית תא. התחל את המדידות, ובדוק בתוכנת BIFL שמספר ההתפרצויות שנרשמו תוך 30 שניות הוא בין 60 ל-90. אם הדגימה מרוכזת יותר, יש לדלל אותה עד שספירת ההתפרצות תיפול בטווח זה. לבסוף, נתח את המדידות. ניתוח אורך החיים של אניזוטרופיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת חשף התפלגות יחידה שמקורה בשני זמני מתאם סיבוביים נפרדים בתחום קשירת ה-DNA של FoxP1, מה שמרמז על דו-קיום של הרכבים מבניים מסודרים ולא מסודרים. ניתוח שונות פרץ זיהה תת-קבוצה של מולקולות FoxP1 המציגות אניזוטרופיה גבוהה וגרסאות עודפות, מה שמרמז על נוכחות של שינויים קונפורמטיביים דינמיים. ניתוח התפלגות הפוטונים הבדיל בין מצבי FoxP1 מונומריים ודימריים, והראה התפלגויות אניזוטרופיות ושערי חליפין מובחנים. דימריזציה השפיעה על תנועות מקומיות וגלובליות ב-FoxP1 עם מדידות שונות עודפות המצביעות על שינויים אנזוטרופיים משמעותיים באתרים ספציפיים המסומנים בציסטאין. ניתוח אניזוטרופיה דינמי גילה כי FoxP1 עובר התפתחות חלקית עם דימריזציה וקשירת DNA, ומשנה את חלק האוכלוסיות המובנות והלא מסודרות.