בידוד ואפיון של נויטרופילים בצפיפות נמוכה ונורמלית מדם מלא

מטרת המחקר שלנו היא להבין את תפקידן של תת-קבוצות נויטרופילים וכיצד הן תורמות לפתוגנזה של מחלות דלקתיות כגון זאבת. במובן רחב יותר, העבודה שלנו מדגימה גם את ההטרוגניות של אוכלוסיות נויטרופילים בביולוגיה האנושית וכיצד זה יכול להשתנות בהתבסס על מצבים פיזיולוגיים משתנים. מחקרים חדשים מראים שאוכלוסיות הנויטרופילים בבני אדם הן הטרוגניות.

עם זאת, נויטרופילים ממשיכים להיחקר כאוכלוסייה אחת בשל הקושי לבודד תת-סוגים באופן אמין ללא הפעלה ובכמות מספקת. הפרוטוקול שלנו מספק שיטה לבידוד בלתי נגוע ואפיון בסיסי של תת-סוגים של נויטרופילים, תוך התגברות על בעיות אלה. מחקרים אחרונים, אם כי מוגבלים, הראו כי תת-סוגים של נויטרופילים, כגון נויטרופילים בצפיפות נמוכה, ממלאים תפקיד במצבים פיזיולוגיים משתנים כמו הריון ודלקת, כמו גם במחלות כמו שחפת, אוטואימוניות וסרטן.

הפרוטוקול שלנו יאפשר מחקר חזק וניתן לשחזור על תרומתם של תאים אלה לבריאות האדם ולמחלות. כעת, לאחר שיש לנו פרוטוקול חזק שנבדק להפרדת נויטרופילים בצפיפות נמוכה מנויטרופילים בצפיפות רגילה, אנו מתמקדים במענה על שאלות בסיסיות הנוגעות לאופן שבו נויטרופילים בצפיפות נמוכה אלה נוכחים בתנאים דלקתיים. אנו מתעניינים במיוחד במה הם שונים מנויטרופילים בצפיפות נורמלית במספר התאים שלהם, בפנוטיפ החיסוני, במטבוליזם החיסוני ועוד.

כדי להתחיל, סמן ארבעה צינורות חרוטיים של 50 מיליליטר לפתרונות עבודה איזוטוניים של 100%81%70% ו-55%הוסף 27 מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות לצינור הראשון שכותרתו 100%הוסף 3 מיליליטר של 10X PBS. לאחר מכן, מדוד את הנפחים הנדרשים של פתרונות עבודה איזוטוניים של 100% ו-1X PBS עבור כל ריכוז של פתרונות העבודה. הוסף אותו לצינורות החרוטיים המתאימים.

השתמש בפיפטה של פסטר כדי לערבב היטב להומוגניות. כעת שכבה בזהירות של 3 מיליליטר של תמיסת העבודה האיזוטונית של 81% בתחתית צינור חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר מכן שכבה איטית ובעדינות של 3 מיליליטר מתמיסת העבודה האיזוטונית של 70% מעל, ומבטיחה שהשכבות לא יתערבבו.

כדי להכין את מאגר הפרדת התאים, שלב סרום בקר עוברי 2%, 1 מילימול EDTA ו-PBS לנפח כולל של 500 מיליליטר. פיפטה לערבב היטב לאחידות. מערבול את החרוזים המגנטיים ביסודיות למשך 30 שניות כדי להבטיח שהם מושעים במלואם לפני השימוש.

עבור כל תורם, יש להקצות 4 מיליליטר של דם מלא לשלושה צינורות תחתונים עגולים נפרדים של 14 מיליליטר. פיפטה 200 מיקרוליטר קוקטייל בידוד נויטרופילים ו -200 מיקרוליטר חרוזים מגנטיים לכל צינור. פיפטה בעדינות את התמיסה כדי להשעות מחדש את התערובת לפני הדגירה כדי לאפשר לריאגנטים להיקשר לתאים לא רצויים.

לאחר מכן, הוסף את מאגר הפרדת התאים לכל צינור כדי להרכיב את הנפח ל-12 מיליליטר ולערבב היטב. מניחים את הצינורות ללא מכסים על מתלה מגנטי ודוגרים. כעת השתמש בפיפטה סרולוגית כדי להעביר בזהירות את תרחיף התאים השקוף המכיל נויטרופילים מכל צינור לצינור נקי חדש.

לאחר מכן הסר את הצינור המקורי מהמגנט. מערבול שוב את החרוזים המגנטיים למשך 30 שניות. הוסף 200 מיקרוליטר של החרוזים המגנטיים לתרחיף התא החדש שהועבר לפני ההשעיה והדגירה כפי שהודגם קודם לכן.

הנח את הצינורות בחזרה על המגנט ללא מכסים. לאחר דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, העבירו את תרחיף התאים השקוף המכיל נויטרופילים מבודדים לצינור חדש. משוך את תרחיפי הנויטרופילים המבודדים המתקבלים מדם מלא לתוך צינור יחיד של 50 מיליליטר.

מלא את הצינור לנפח כולל של 50 מיליליטר באמצעות מאגר הפרדת התאים. צנטריפוגה עם השבירה, ואז השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור הנויטרופילים במיליליטר אחד של מאגר הפרדת תאים. לאחר צנטריפוגה נוספת של המתלה, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור הנויטרופילים ב -3 מיליליטר של מדיום השיפוע בצפיפות של 55%.

שכב לאט את 3 מיליליטר של מדיום שיפוע בצפיפות 55% המכיל את מתלה התא על צינורות שיפוע הצפיפות שהוכנו מראש, תוך הימנעות מהפרעה של השיפוע. צנטריפוגה את הצינורות בטמפרטורה של 720 גרם למשך 30 דקות מבלי להשתמש בהפסקה. לאחר הצנטריפוגה, טפל בצינורות בזהירות כדי למנוע הפרעה לשכבות.

בעזרת פיפטת העברה, בודדו בזהירות את השכבות הנפרדות המכילות נויטרופילים בצפיפות נמוכה ונורמלית והעבירו אותם לצינורות נפרדים של 15 מיליליטר. כדי לשטוף כל מדיום שיפוע בצפיפות שיורית, הוסף PBS לכל צינור של 15 מיליליטר עד לסימון 15 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה בחום של 400 גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עם ההפסקה.

ספרו את התאים בכל שבר על המוציטומטר לפני ניסויים נוספים. השכבות של הנויטרופילים הכוללים על תווך שיפוע הצפיפות הביאו להיווצרות מוצלחת של שתי רצועות נפרדות. כאשר הנויטרופילים בצפיפות נמוכה יוצרים רצועה עליונה והנויטרופילים בצפיפות הנורמלית יוצרים רצועה תחתונה.

עומס יתר על מדיום שיפוע הצפיפות בנויטרופילים מעל 5-6 מיליון תאים למיליליטר גרם ללהקות להיראות מפוזרות, מה שהגדיל את הסיכון לערבוב תת-סוגים. טוהר הבידוד הממוצע היה 93.8% עבור נויטרופילים בצפיפות נמוכה, ו-96.3% עבור נויטרופילים בצפיפות רגילה עם זיהום מינימלי מסוגי תאים אחרים.