שיטה חדשנית ויעילה לצביעה פלואורסצנטית של לב דרוזופילה עם הקפאה

מעבדת המחקר שלי משתמשת במודל דרוזופילה כדי לחקור הזדקנות והפרעה מטבולית, וחוקרת הזנה מוגבלת בזמן ופעילות גופנית כהתערבות במחלות מטבוליות, שרירי לב, שינה ומחלות הזדקנות אחרות. למידת מכונה ו-omic עם אסטרטגיה גנטית ותזונתית פיזיולוגית מייעלים את בדיקת הדרוזופילה באמצעות מכשירים מודפסים בתלת מימד וגישות למידת מכונה. אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית של לבבות דרוזופילה מאפשרת זיהוי רב חלבונים על פני גנוטיפים וגילאים, אך מתמודדת עם אתגרים כמו דיסקציות מורכבות, שימור רקמות והדמיה ברזולוציה גבוהה של דפוסי ביטוי חלבון ספציפיים.

פרוטוקול זה משפר את שימור הרקמות, חדירת הנוגדנים ורזולוציית ההדמיה, ומאפשר הדמיה טובה יותר של סמני חלבון לבביים. הוא מתמודד עם אתגרים כמו דיסקציה מורכבת, נזק לרקמות ורזולוציה מוגבלת בשיטת הרכבה מסורתית של לב שלם. פרוטוקול זה משפר את הנגישות לחקר הלב של דרוזופילה על ידי ביטול דיסקציה מורכבת, מאפשר ביצוע ביד אחת והימנעות ממיקרוסקופיה קונפוקלית יקרה, מה שהופך את ההדמיה ברזולוציה גבוהה לאפשרית יותר.

כדי להתחיל, הרדמו 5 עד 10 זבובים באמצעות מחצלת זבוב פחמן דו חמצני. מקמו את הזבובים בטווח הראייה מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של פי 1 עד פי 2. בעזרת מספריים קפיציים, ערפו את ראשי הזבובים, קצצו את הכנפיים והסירו את הרגליים.

שמור על בית החזה והבטן יחד, המכונה הגוף. בעזרת מברשת, הניחו בעדינות את הגופות בצינורות מסומנים של 1.5 מיליליטר על קרח עד שכל קבוצות הניסוי נאספו. לאחר הוצאת הצינורות מהקרח, הוסף 100 מיקרוליטר של חומצה טטראצטית אתילן גליקול 10 מילי-מולרית ב-pH 8 לכל צינור.

ודא שכל הגופים שקועים והנח את הצינורות על שייקר אורביטלי למשך 10 דקות. לאחר מכן, הסר והשליך את תמיסת החומצה הטטראצטית אתילן גליקול מהצינורות. פיפטה 100 מיקרוליטר PBS לכל צינור כדי לשטוף את הטישו למשך 10 דקות.

הנח את הצינורות על שייקר המסלול במהלך תהליך הכביסה. לאחר השלכת ה-PBS, פיפטה 100 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד בתמיסת PBS לכל צינור. הנח את הצינורות על שייקר אורביטלי ב-100 יחידות למשך 15 דקות, וודא שהרקמות יישארו במגע עם התמיסה.

לאחר מכן, השליכו את תמיסת הפרפורמלדהיד. לאחר השלמת הכביסה הסופית, העבירו את הגופות לתמיסה של 10% סוכרוז ב-PBS. ודא שהגופים נמצאים במגע עם התמיסה בתוך הצינור.

אחזר קרח יבש מהאחסון ובחר כמה חלקים להצבה במגש מתכת או פלסטיק קטן. בחרו מגש עם מידות המאפשרות להכניס את התבנית והניחו אותה ישירות על גבי חתיכת קרח יבש אחת גדולה ושטוחה. מלאו תבנית מסומנת עד 50% בטמפרטורת חיתוך אופטימלית, או תרכובת OCT, ושפכו לאט כדי למזער בועות.

בעזרת מברשת, הניחו בזהירות את גופי הדרוזופילה המנותחים והקבועים על פני תרכובת ה-OCT בתוך התבנית. בעזרת מלקחיים, דחפו כל גוף לתחתית התבנית כאשר הדופן הגבית של בית החזה והבטן מיושרות בדרך כלל לאורך החלק התחתון. התאם את הגופים כך שהבטן תשכב שטוחה לאורך תחתית התבנית.

יישר את כל הגופים במידות X, Y ו-Z כדי להבטיח שכל חלק יכלול את כל הנושאים בו זמנית. תקן את עקמומיות הבטן, במיוחד אצל גברים, כדי לשטח אותה ככל האפשר מבלי לנקב או לרסק את הגוף. לאחר שכל הנושאים נמצאים במקומם, מקם את התבנית כך שהתחתית תשב ישירות על גבי חתיכת קרח יבש.

ודא שתרכובת ה-OCT מתחילה לקפוא במגע והמשך עד שכל הנבדקים עטופים במלואם בתבנית. לאחר ההקפאה מעבירים את התבנית למקפיא המוגדר למינוס 20 מעלות צלזיוס כדי לאפשר הקפאה מלאה לאורך כל הדרך. לאחר הקפאה מלאה, מלאו את החלק הנותר של התבנית בתרכובת OCT.

כדי לחבר מעט צ'אק לתבנית, מרחו כמות נדיבה של תרכובת OCT על הבלוק. לחץ על הביט שטוח על התרכובת ואפשר לו לקפוא לחלוטין בקריוסטט, בדרך כלל תוך חמש דקות. לאחר מכן שחרר את סיבית הצ'אק ואת בלוק ה-OCT מהתבנית.

הנח את הביט לתוך הצ'אק, וודא שהבלוק נשאר מכוון כראוי מלמעלה למטה והדק את מפתח הצ'אק כדי לאבטח את הביט. כעת, באמצעות כפתורי הכוונון ובקרות עומק הצ'אק, יישר את הבלוק עם הלהב והגדר את רוחב החלק ל-20 מיקרומטר ומטה. חותכים כל פרוסה מהבלוק בתנועה איטית אך עקבית, מה שמאפשר לזכוכית נגד גלגול ללכוד כל פרוסה בזמן שהיא נחתכת.

אוספים את החלקים באמצעות שקופיות מחוממות. בעזרת סכין גילוח, הסר את תרכובת ה-OCT העודפת המקיפה את החלקים. מתאר את הגבול של כל שקופית באמצעות טוש הידרופובי כדי לשמור על תמיסות שטיפה וכתמים מוגבלות לרקמה.

בעזרת פיפטה של 1000 מיקרוליטר, שטפו את השקופיות שלוש פעמים עם PBS למשך חמש דקות כל אחת מבלי לגעת ברקמה. לאחר השלכת הכביסה הסופית, פיפטה את תמיסת הכתם הפלואורסצנטי על הרקמות ודגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן, השליכו את הכתם הפלואורסצנטי ושטפו את השקופיות שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחת עם PBS.

לאחר מכן, השליכו את שטיפת ה-PBS הסופית, והשאירו כמות קטנה של תמיסה על המגלשה. בעזרת פיפטה של 1000 מיקרוליטר, פיפטה שלוש עד חמש טיפות של אמצעי הרכבה על המגלשה, הימנעות ממריחה ישירה על הרקמה. בעזרת מלקחיים, מקם את החלקת הכיסוי בקצה אחד והורד בהדרגה את הצד השני עד שהוא סומק עם המגלשה.

אטמו שקופיות עם לק ללא ניאון או נצנצים. אם אמצעי ההרכבה אינו מתקשה, בהתאם לכתם הפלורסנט, צלם מיד או אחסן את השקופיות למועד מאוחר יותר. לפני ההדמיה, בדוק את המגלשות לניקיון ונקה אותן בעדינות באמצעות מגבון טישו עם 70% אתנול בתמיסת מים.

נתח את הנבדקים הפלואורסצנטיים הבהירים ביותר בניסוי כדי לבחור זמני חשיפה מתאימים לכל ערוץ פלואורסצנטי. סקר כל קבוצת ניסוי בתצוגה חיה עבור כל הערוצים כדי לאשר את הגדרות החשיפה הנכונות. לעקביות, התמקדו בכל נושא באמצעות אותו ערוץ פלואורסצנטי וצלמו תמונות עבור כל נושאי הצילום.

לאחר ההדמיה, אחסן את השקופיות בחושך בארבע מעלות צלזיוס לצילום מחדש של תמונה בעתיד. שיטת ההדמיה הקרינה שימרה מאפיינים מרכזיים של לב הדרוזופילה, כגון האוסטיה, השסתום, סיבי האורך והסיבים ההיקפיים. כל מבנה צינור הלב והמבנים הקטנים המפורטים נלכדו בהגדלות שונות, כאשר פי 10 לכל המבנה והגדלות של פי 40 עד פי 60 הראו פרטים עדינים יותר, כגון סיבים מתכווצים היקפיים וסיבים מייצבים אורכיים.

מיקרוגרפים פלואורסצנטיים מייצגים הדגימו מבני לב שמורים בדרוזופילה w1118 עם גרעינים מוכתמים ב-DAPI, ליפידים מוכתמים בירוק ומיופיברילים המכילים אקטין מוכתמים באדום עם פלואידין. צביעת פלואידין הדגישה ביעילות את הסיבים האורכיים וההיקפיים, והדגימה את מבנה חוטי האקטין השמור למרות מתחי הקפאה וחתך. כתמי שומנים חשפו אחסון שומן הממוקם ליד צינור הלב.