פיתוח והערכה של מודלים של זיהום תוך-תאי לסטפילוקוקוס זהוב

המחקר שלנו מתמקד בזיהומי סטפילוקוקוס זהובים במטרה לבסס מודל זיהום בין-תאי. מודל זה יספק תובנות חשובות לגבי המנגנון העומד בבסיס זיהומים בין-תאיים ויתרום לפיתוח גיל קפדני למניעתם וטיפול בהם. ההתקדמות האחרונה בזיהום תוך-תאי של סטפילוקוקוס זהוב היא לחקור את מנגנון הזיהום כדי לווסת את ההישרדות והתפשטות החיידקים בתוך התא, ויוסיף לייעל את התרופה ואת השינוי המבני כדי לשפר את האפקט הטיפולי יותר.

תחום מחקר זה משתמש בתרבית תאים, טכנולוגיית ריצוף תאים מתפתחת, תרמיות חמצן עתירות דלק, טכנולוגיית עריכת גנים וטכנולוגיות קשורות אחרות כדי לחקור זיהום חיידקים בתאים. בניגוד למודלים המסורתיים של זיהום, חידדנו את תנאי הניסוי הספציפיים לזיהומים תוך-תאיים. לאחר הדבקת תאים בסטפילוקוקוס זהוב בנפרד, התאים הנגועים בחיידק מחוסנים לעכברים כדי ליצור זיהומים תוך-תאיים.

גישה זו משפרת את היעילות על ידי מזעור ההפרעות של החיידקים החופשיים, ומבטיחה שמירה מדויקת יותר על תהליך הזיהום התוך-תאי. השיטה שלנו תתמקד בפיתוח תרופות נוגדנים ותקדם למניעה וטיפול בזיהומים חיידקיים בעתיד. להכנת מרק עמילן 6%, הוסיפו אבקת תמצית בקר, טריפטון ונתרן כלורי למיכל זכוכית ברציפות ביחס מסה של 3 עד 10 עד 5.

מוסיפים 100 מיליליטר מים מזוקקים כפולים ומערבבים להמסת הרכיבים. מחממים את התמיסה במיקרוגל. לאחר מכן, מוסיפים עמילן מסיס ביחס מסה של 6 ומערבבים את התערובת עד להמסה מלאה.

חיטוי המרק בחום של 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר העיקור, אחסנו את הציר בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, עד ליצירת משחה. כדי לאסוף מקרופאגים צפקים של עכבר, בעזרת יד שמאל, תפסו את צוואר העכבר ושלטו בזנבו.

לאחר מכן, הפוך את העכבר כך שראשו ממוקם כלפי מטה והבטן שלו פונה כלפי מעלה. יש לתת זריקה תוך-צפקית של שלושה מיליליטר של מרק עמילן 6% לעכבר. לאחר 72 שעות של הזרקה יש להקריב את העכבר המורדם ולחטא אותו באלכוהול אתילי 75%.

בעזרת מספריים עיניים, חתוך את בטן העכבר כדי לחשוף את הצפק במלואו. הזרקת 10 מיליליטר DMEM לחלל הבטן באמצעות הזרקה תוך צפקית. שפשפו בעדינות את הבטן למשך דקה אחת כדי לשטוף את החלל.

לאחר מכן, השתמש במזרק כדי לאסוף את הנוזל השטוף לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. צנטריפוגה את נוזל השטיפה ב -300 גרם למשך חמש דקות, והשליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את גלולת התא ב-10 מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FBS, פניצילין וסטרפטומיצין.

קח 10 מיקרוליטר של תרחיף תאים והוסף אותו למונה התאים כדי לספור את התאים. מדללים את התאים לריכוז של 2 פעמים 10 בחזקת 6 תאים למיליליטר עם DMEM FBS. צלחת מיליליטר אחד של מתלה תאים לכל באר על צלחת שש בארות.

דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך ארבע שעות. לאחר הדגירה, הסר את הסופרנטנט. שטפו את התאים פעמיים עם PBS סטרילי ותרבו אותם למשך הלילה עם מיליליטר אחד של DMEM לבאר באותם תנאים.

דגרו על המקרופאגים הצפק עם סטפילוקוקוס זהוב MRSA-252 למשך שעתיים. הסר את הסופרנטנט ושטוף את התאים פעמיים עם PBS. הוסף מיליליטר אחד לבאר של מדיום DMEM שלם המכיל 100 מיקרוגרם למיליליטר גנטמיצין ודגר במשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני.

לאחר הדגירה יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. בעזרת מגרד תאים, אוספים את המקרופאגים הצפק לצינורות צנטריפוגות של 50 מיליליטר. צנטריפוגה את הדגימות ב 1000 גרם למשך חמש דקות.

הוסיפו 10 מיקרוגרם למיליליטר ליזוזים למקרופאגים הנגועים ב-MRSA-252 תוך תאי, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר שטיפת התאים פעמיים עם PBS, השעו אותם מחדש במיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן, הוציאו כ-20 מיקרוליטר של אליקוט והוסיפו 0.1% טריטון X-100 למשך חמש דקות כדי ליז את התאים.

בצע דילולים סדרתיים של תרחיף התאים הליזי עם PBS ושחרר אותם על צלחת מקדחת סויה טריפטית. דגרו את הצלחת למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס. למחרת, ספרו את מושבות החיידקים כדי לחשב את חיידקי MRSA-252 התוך-תאיים במקרופאגים צפקיים.

הנח את העכבר מתחת למנורת פיזיותרפיה אינפרא אדום עד להרחבת וריד הזנב. חלקו את העכברים באופן אקראי לארבע קבוצות. הזרקה תוך ורידית 3 פעמים 10 בעוצמה של 6 CFU Planktonic MRSA-252 לווריד הזנב של העכבר.

לאחר 24 שעות יש להקריב את העכבר המורדם ולחטא אותו היטב באלכוהול אתילי 75%. השתמש בפינצטה ביד אחת כדי להרים את עור הבטן וביד השנייה לחתוך את העור בעזרת מספריים עיניים. אתר את הכליות בחלל הבטן והפשיט אותן בזהירות לחלוטין.

מעבירים את הכליות לצינור טחינה המכיל מיליליטר PBS, וטוחנים אותן עד שלא נשארת רקמה מוצקה. יוצקים את הרקמה ההומוגנית לתוך צינור אפנדורף. בצע דילול סדרתי של הרקמה הומוגנטית באמצעות PBS.

אתר כל דילול על צלחות מקדחת סויה טריפטיכון נפרדות ודגר אותן למשך הלילה ב -37 מעלות צלזיוס. ספרו את מושבות החיידקים למחרת ונתחו את הנתונים. מודלים של זיהום תוך-תאי של S.aureus הוקמו בהצלחה בתנאי פגוציטוזיס אופטימליים וטיפול אנטיביוטי ממושך עם כמה חיידקים ששרדו בתוך מקרופאגים.

מקרופאגים הנגועים ב-S.aureus עמיד למתיצילין שמרו על חיידקים תוך-תאיים לאחר שעתיים של טיפול אנטיביוטי כאשר הסופרנטנט כבר לא הכיל חיידקים. in vivo, מבחני קולוניזציה של חיידקים בעכברים הראו כי ונקומיצין חיסל S.aureus חוץ-תאי, אך לא הצליח לנקות חיידקים תוך-תאיים.