ניתוח ביטוי אונקוגנים עם שינויים ב-pH בקו תאי צינור הלבלב
11 באפריל 2025
מחקר זה מתאר פרוטוקול לבחינת ההשפעות של שינוי pH על ביטוי אונקוגן באמצעות ניתוח RNA-seq של קו תאי צינור הלבלב.
בבתי החולים של AIG, אנו חוקרים כיצד ירידה בהפרשות צינורות הלבלב וירידה ב-pH משפיעות על ביטויי הגנים בתאי צינור הלבלב, במיוחד תוך התמקדות באונקוגנים, ובוחנים את האפשרות של הסתגלות תאית למיקרו-סביבות חומציות. האתגר כאן הוא ההטרוגניות של גידולי הלבלב, מה שמסבך את הטיפול כמו גם את הגישות הניסיוניות. לכן ערכנו ניתוח RNAC של תאי צינור הלבלב בתנאי pH מופחתים, ומצאנו שיש ביטוי מוגבר של שלושה אונקוגנים המדגישים את הקשרים הפוטנציאליים בין הסביבה החומצית לביטוי אונקוגנים בתאי צינור הלבלב.
המחקר שלנו שפך אור על ביטוי האונקוגן בתנאי pH מופחתים, ומערכת זו יכולה לקדם את המחקר שלנו בחקר אדנוקרצינומה של צינור הלבלב בתנאי דלקת. לכן ההיקף העתידי של מחקר זה הוא להעריך את התפקיד של ביטויים אונקוגנים מוגברים בהתחלת גידולים בתנאים דלקתיים, כגון בדלקת לבלב כרונית. כדי להתחיל, רכשו את קו תאי צינור הלבלב הרגיל האנושי.
הפשירו את התאים ב-37 מעלות צלזיוס באמבט מים. כעת מסננים מדיום שלם שהוכן טרי דרך פילטר מזרק. הוסף שישה מיליליטר של מדיום שלם לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר.
לאחר מכן העבירו את תרחיף התאים המופשר לצינור וערבבו היטב. צנטריפוגה את המתלה ב -1, 800 גרם למשך שש דקות. השליכו את הסופרנטנט והוסיפו מיליליטר אחד של מדיום תרבית לגלולה לפני ערבוב עדין.
לאחר מכן, הוסיפו ארבעה מיליליטר של מדיום שלם לצלחת פטרי בגודל 60 מילימטרים. לאחר מכן פיפטה את מתלה התא טיפה לתוך הבקבוק. דגרו את התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת תוספת פחמן דו חמצני של 5%.
כדי לשנות את ה-pH של מדיום התרבית, ראשית, הכינו 100 מיליליטר של תמיסות מלאי חיץ נתרן פוספט מולארי עם ערכי pH של 6.0, 6.5 ו-7.0. בדוק את ה-pH עם מד pH והתאם אותו באמצעות חומצה הידרוכלורית טוחנת אחת או נתרן הידרוקסיד טוחנת אחת. לאחר מכן סנן, עקר את המאגרים במכסה זרימת אוויר למינרי באמצעות מסנן מזרק של 0.45 מיקרומטר.
לאחר מכן, הוסף 20 מיליליטר של מאגר נתרן פוספט סטרילי 0.5 מולרי של ה-pH המתאים ל-80 מיליליטר של מדיום תרבית להכנת מדיה של pH שונה. הוסף את המדיה עם ה-pH השונה לתאי צינור הלבלב האנושיים של 85 עד 90%. צפו בשינויים מורפולוגיים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר במרווחים של שעה למשך שש שעות.
כדי לבודד RNA מהתרבית, יש לשאוף תחילה את מדיום התרבות ולשטוף את התאים במיליליטר אחד של PBS. מניחים את צלחת ה-60 מילימטר על קרח, ואז מיליליטר אחד של PBS לכלי ה-60 מילימטר ומגרדים את התאים בעזרת מגרד תאים. כעת העבירו את המתלים לצינור טרי.
צנטריפוגה בטמפרטורה של 8, 000 גרם למשך 10 דקות והשליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, הוסף 600 מיקרוליטר של מאגר ליזה המכיל בטא-מרקפטואתנול לגלולה. פיפטה את המתלים למעלה ולמטה במשך חמש עד 10 דקות על קרח.
הוסף נפח שווה של 70% אתנול לליזאט ופיפטה את התרחיף לערבב היטב. העבירו את התמיסה לעמוד קרום סיליקה. לאחר מכן צנטריפוגה של העמודה ביותר מ -8, 000 G למשך 30 שניות והשליכו את הזרימה דרכם.
לאחר מכן, הוסף שוב 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה לדגימה ולצנטריפוגה. צנטריפוגה את הצינור הריק למשך דקה אחת ביותר מ -8, 000 גרם.לבסוף, הוסף 30 עד 50 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז לעמודה. לאחר דגירה של חמש דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה את העמוד שוב במהירויות גבוהות מ- 8,000 גרם למשך חמש דקות.
נצפתה ירידה משמעותית בגודל התא והתכווצות התאים הרקיעיים בתווך חומצי בהשוואה לתאים שנשמרו בתווך רגיל. השינויים הבולטים ביותר במוות התאים התרחשו לאחר שש שעות דגירה עם ירידה נוספת בספירת התאים וסימני לחץ תאי לאחר 22 שעות. מספר הגנים המווסתים היה הגבוה ביותר ב-pH 6.5 עם 148 גנים ואחריו pH 7 עם 109 גנים ו-pH 6 עם 90 גנים.
גנים מווסתים היו פחותים עם 20 ב-pH 6, 14 ב-pH 6.5 ו-23 ב-pH 7. שלושה אונקוגן, LCK, FGR ו-ASAP שלושה היו מווסתים בכל רמות ה-pH שנבדקו, מה שמרמז על תפקיד בהתפשטות תאים בתנאים חומציים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן כיצד ירידה ב-pH משפיעה על ביטוי של אונקוגנים בתאי צינור הלבלב באמצעות ניתוח RNA-seq. הממצאים מצביעים על קשר בין סביבות חומציות לבין עלייה בביטוי אונקוגנים, דבר שעשוי להנחות מחקרים עתידיים על אדנוקרצינומה של צינור הלבלב.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אונקולוגיה
- ביולוגיה של התא
- ביטוי גנים
רקע
- הפרשות תעלת הלבלב עלולות לפחות, מה שיוביל לשינויים ברמות ה-pH.
- סביבות מיקרו acidified עשויות להשפיע על ביטוי גנים בתאי תעלת הלבלב.
- ההטרוגניות של גידולי הלבלב מסבכת את הטיפול ואת המחקר.
- הבנת ביטוי האונקוגנים בתנאים אלו היא קריטית למחקר הסרטן.
מטרת המחקר
- בחינת ההשפעות של pH מופחת על ביטוי אונקוגנים בתאי צינור הלבלב.
- חקירת מנגנוני הסתגלות תאיים לסביבות חומציות.
- אספקת תובנות לגבי תפקידם של אונקוגנים בסרטן הלבלב תחת תנאים דלקתיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניתוח RNA-seq של תאי צינור הלבלב.
- השוואה של ביטוי גנים בתנאי pH רגילים ותנאי pH מופחתים.
- התמקדות בשינויים בביטוי של אונקוגנים.
- הערכה של קשרים פוטנציאליים בין סביבות חומציות לפעילות של אונקוגנים.
תוצאות עיקריות
- נצפתה ביטוי מוגבר של שלושה אונקוגנים בתנאי pH נמוך.
- הממצאים מצביעים על קשר פוטנציאלי בין סביבות חומציות לבין ביטוי של אונקוגנים.
- המחקר מדגיש את חשיבות ה-pH בביולוגיה של תאי נישוב הלבלב.
- תוצאות אלו עשויות לקדם את ההבנה של אדנוקרצינומה של נישוב הלבלב.
מסקנות
- pH משתנה משפיע באופן משמעותי על ביטוי אונקוגנים בתאי צינור הלבלב.
- מחקרים עתידיים צריכים להעריך את תפקידם של אונקוגנים ביצירת גידולים תחת תנאים דלקתיים.
- מחקר זה מספק בסיס לחקירות נוספות של מנגנוני סרטן הלבלב.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנה של האופן שבו מיקרו-סביבות חומציות מניעות ביטוי של אונקוגנים בתאי צינור הלבלב נותנת מענה לאתגר קריטי בביולוגיה של סרטן בשלבים מוקדמים ובתיקוף של מטרות טיפוליות. תהליך עבודה זה, המבוסס על RNA-seq, מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי קישור גורמי עקה סביבתיים להפעלת גנים, ובכך מספק מידע למודלים חיזויים של התחלת גידולים בהקשרים דלקתיים. גישה זו תומכת בקבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח על ידי הבהרת הסיכון הביולוגי במערכות רלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקת הפעלת אונקוגנים תחת תנאים חומציים רלוונטיים פיזיולוגית.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מיפוי שינויים בביטוי גנים אל מול גורמי עקה סביבתיים.
- מבהיר את תפקידו של ה-pH של המיקרו-סביבה בתיקוף פונקציונלי של מטרות לסרטן הלבלב.
- מספק ביטחון חיזוי לצורך מיון תיקי פיתוח בשלבים מוקדמים בתוכניות אונקולוגיות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מבסס מערכת תאית מתוקפת להערכת ביטוי גנים תחת תנאי pH מבוקרים.
- מאפשר תהליכי עבודה של RNA-seq הניתנים לשחזור לצורך הערכה כמותית של ביטוי גנים דיפרנציאלי.
- מאפשר סטנדרטיזציה של תנאי הבדיקה עבור סריקת תרכובות בשלבים הבאים בסביבות מיקרו-אקלימיות חומציות.
- מספק פלטים כמותיים להערכת מוכנות הבדיקה ויכולת ההרחבה של הפלטפורמה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה ממצאים in vitro לגורמים של מיקרו-סביבה הרלוונטיים למחלה שנצפו בפנקריאטיטיס כרונית וב-PDAC.
- תומכת ברציפות תרגומית על ידי מידול טריגרים להיווצרות גידול במערכות פרה-קליניות.
- מאפשרת קבלת החלטות על קידום מבוסס התאמת סיכונים, בהסתמך על תובנות מכניסטיות לגבי הפעלת אונקוגנים.
- מחזקת את הערך הניבוי לגילוי ביומארקרים בתהליכי קרצינוגנזה המונעים מדלקת.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
תהליך עבודה זה של RNA-seq ממצב את המודולציה של pH חומצי ככלי בשלב הגילוי לקישור בין עקה סביבתית להפעלה של אונקוגנים, ובכך מגשר בין בדיקת השערות ראשונית לפיתוח מודלים פרה-קליניים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי ההשפעה של עקה חומצית על ביטוי גנים ועל הסיכון להתחלת גידול.
- סריקה: מספקת פלטפורמה כמותית הניתנת לשחזור להערכת שינויים בביטוי גנים על פני מדרגי pH.
- אנליטיקה: מספקת נתונים של ביטוי גנים דיפרנציאלי להשוואת הפעלת אונקוגנים תחת תנאים מוגדרים.
- מחקר תרגומי: ממדלת מיקרו-סביבות רלוונטיות למחלה כדי להנחות אסטרטגיות של תיקוף פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה תהליך עבודה ניתן להרחבה שניתן להתאימו לקווי תאים אחרים ולמשתנים סביבתיים אחרים במחקר אונקולוגי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות על ידי קישור גורמים סביבתיים לביטוי אונקוגנים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של פרוטוקולי RNA-seq ותרביות תאים למען הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות המשך (go/no-go) באמצעות הבהרת הסיכון המכניסטי בתוכניות אונקולוגיות בשלבים מוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות ומודלים מותאם סיכון בהתבסס על תגובתיות סביבתית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות תאים, ויסות pH ואנליזה של RNA-seq.
- נדרשת גישה לפלטפורמות של ריצוף מהדור הבא (next-generation sequencing) וכלים של ביואינפורמטיקה לניתוח ביטוי דיפרנציאלי.
- נדרשת סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים בפרוטוקולים של התאמת pH ועיבוד דגימות.
- התאמה לסוגי תאים אחרים או למודלים של מחלות עשויה לדרוש אופטימיזציה של פרמטרים סביבתיים.
- פרשנות של שינויים בביטוי גנים חייבת להתחשב בחיוניות התאים ובמגבלות תגובת העקה (stress response).
