מדידת זרימה-ציטומטריה בתפוקה גבוהה של מכאנוטיפ תאי המבוססת על קרע ואספקה של בדיקות מתח DNA לתאים
13 ביוני 2025
שיטה זו מודדת את נטייתו של התא לקרוע דופלקסים משותקים של DNA המציגים ליגנד כדי לדווח על כוחות משיכה תאיים יחסיים. אוליגואים פלואורסצנטיים קרועים מועברים לתא ומנותחים על ידי ציטומטריית זרימה, ומתעדים את ההיסטוריה המכנית של התא. זה מאפשר מדידה בתפוקה גבוהה של יצירת כוח סלולרי בהקשר של מכנינוטיפ תאי.
המעבדה שלנו חוקרת בדרך כלל מנגנונים מולקולריים שבהם תאים משתמשים כדי להעביר גירויים מכניים. לאחרונה פיתחנו שיטות בעלות תפוקה גבוהה למדידת הכוחות שתאים מפעילים על סביבתם כדי להביא את המכנוביולוגיה לעידן האומיקס. מחקרים מצביעים על כוחות מכניים באופן שבו תאי T מופעלים על ידי האנטיגן הנכון וכיצד תאי גזע מתמיינים לסוגי תאים מיוחדים.
לאחרונה, תהליכים ממוקדים העומדים בבסיס מכניקת תאים לא מווסתת הובילו לפיתוח מכותראפוטיקה כדרך לטיפול במחלות. חיישני דופלקס DNA וסיכת ראש מודדים כוחות חוץ-תאיים, בעוד שחיישנים מקודדים גנטית מאפשרים מדידות תוך תאיות. כמעט כולם דורשים מיקרוסקופים מתקדמים.
מיקרוסקופ כוח משיכה יכול למדוד את הכוח שהתאים מפעילים על סביבתם, אך גם הוא כרוך בהדמיה ברזולוציה גבוהה. אנו מתמודדים עם שלושה אתגרים בתחום בעבודה זו, האחד, שימוש בזרימה ציטומטרית למדידת כוח במקום הדמיה, שניים, שימוש בטכנולוגיית תג HOH לחיבור ליגנדים ונוגדנים לבדיקות DNA, ושלישי, שימוש בלוחות תרבית תאים סטנדרטיים ללא טיפולי שטח מיוחדים. כיצד שינויים בכוחות שנוצרו בתאים יכולים לשמש כסמן פרוגנוסטי למצב המחלה, והאם כוחות אלה תורמים למצב המחלה האמור, או שהם השפעה משנית שלו?
כדי להתחיל, הרכיבו דופלקסים ביחס מולארי של 1.1 לאחד של גדיל עוגן עם מרווה לגדיל ליגנד עם פלואורופור. הכן את הדופלקסים בריכוז סופי של 40 גדילי ליגנד מיקרומולריים בתמיסה. לחישול הדופלקסים המורכבים, דגרו אותם בטמפרטורה של 98 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.
לאחר מכן, תנו לתערובת להתקרר בטמפרטורת החדר למשך שעה הרחק מאור. השב את הדופלקסים המחוסמים עם HUH באמצעות ריכוז הגדיל הכי פחות שופע משלב החישול, שבמקרה זה, הוא גדיל הליגנד. מערבבים את הדופלקסים עם HUH ביחס מולארי אחד עד שניים בריכוז סופי של 10 דופלקס מיקרו-מולרי ו-20 מיקרו-מולרי HUH.
דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות במחזור תרמי או בלוק חום מוגן אור. לאחר הדגירה, הסר את התגובה מהאש והשתמש בצנטריפוגה מיני ספסל כדי לסובב את קשרי מד המתח שהורכבו כעת, או TGTs. כאשר ה- TGTs נדבקים כראוי, שטפו את הבארות בתאים הרצויים שלוש פעמים עם PBS.
לאחר מכן יש שתי שטיפות באמצעות מדיה נטולת סרום ולהשאיר את המדיה בבארות לאחר הכביסה האחרונה. הוסף 200 מיקרוליטר PBS לבארות ההיקפיות כדי להפחית את השפעות הקצה. העבירו את הצלחת לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס כדי לחמם את הצלחת מראש.
לאחר מכן, אחזר את התאים המעניינים בכ-80% מפגש. שאפו את המדיה, ואז שטפו את התאים עם PBS ודגרו על התאים עם טריפסין בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהתאים מתנתקים, מה שלוקח כחמש עד 10 דקות. לאחר ניתוק התאים, הוסף את הנפח המקורי של מדיה תאית שלמה המשמשת לתחזוקת התאים.
השעו מחדש את התאים באמצעות פיפטה סרולוגית והעבירו את תרחיף התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה את התאים ב -300 גרם למשך ארבע דקות. שאפו את המדיה והשעו מחדש את הגלולה ב-PBS.
לאחר חזרה על הצנטריפוגה, השעו מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של מדיה וצנטריפוגה נטולת סרום. שאפו והשעו מחדש את התאים בכשני מיליליטר של מדיה נטולת סרום. קבע את צפיפות התאים התלויים כדי להתאים את הריכוז כרצונך.
לחלופין, אם בודקים את השפעות התרופה, הוסף את הריכוז המתאים של התרופה לתאים והחזיר את התאים לחממה לזמן טרום הדגירה לפני שתמשיך. כעת, הוציאו את הצלחת המקורית מהחממה והוציאו את שאריות המדיה שנותרו מהשטיפה בבארות הניסוי. שטפו את הבארות פעם אחת עם המדיה הרצויה ופיפטה 100 מיקרוליטר מהתאים התלויים לבארות הרצויות.
העבירו את התאים המצופים לחממה למשך 90 דקות. לאחר הדגירה, הסר כ-125 עד 170 מיקרוליטר נפח מכל באר. במידת הצורך יש לשטוף את התאים בעדינות עם 200 מיקרוליטר PBS מחומם.
לאחר מכן, דגרו על התאים בכל באר עם 50 מיקרוליטר טריפסין עד שהתאים מתחילים להתנתק, מה שלוקח כחמש עד 10 דקות. לאחר מכן, הוסף 160 מיקרוליטר של מאגר זרימה טרי שהוכן לכל באר. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים.
העבירו 196 מיקרוליטר של תרחיף תאים זה לצינורות PCR, הוסיפו ארבעה מיקרוליטרים של יודיד פרופידיום וערבבו בעדינות. לבסוף, הניחו את הצינורות בדלי קרח עם מכסה החוסם כל אור ומדדו את עוצמת הקרינה באמצעות ציטומטר זרימה. שער ציטומטריית זרימה אישר בידוד מוצלח של תא בודד, והבטיח ניתוח מכניאוטיפ מדויק.
שער בקרה שלילי, שנקבע באחוזון ה-99 של הקרינה Cy5-A, סיפק בסיס להשוואה בין תנאי הניסוי. תאי CHO-K1 שטופלו ב-Y27632 הראו ירידה משמעותית באחוז התאים החורגים משער הבקרה השלילי בגזירה TGTs, בעוד ששחרור רוכסן TGTs הראה ירידה צנועה וחסרת משמעות סטטיסטית בלבד. פתיחת רוכסן TGTs הביאה באופן עקבי לאחוז גבוה יותר של תאים החורגים מהבקרה השלילית בהשוואה לגזירה TGTs, מה שאישר את דרישת הכוח הנמוכה יותר שלהם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
המחקר הזה מציג שיטה למדידת נטייה של תא לשבור דו-גדילי DNA קבועים המציגים ליגנד, אשר מדווחים על כוחות מתיחה תאיים יחסיים. הגישה מאפשרת מדידה בתפוקה גבוהה של יצירת כוח תאי, ותורמת לתחום המכאנוביולוגיה.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מכאנוביולוגיה
- מכניקה תאית
- טכניקות מדידה בתפוקה גבוהה
רקע
- תאים מעבירים גירויים מכניים דרך מנגנונים מולקולריים שונים.
- הבנת כוחות תאיים היא חיונית לתובנות על הפעלת תאי T והתמיינות תאי גזע.
- מכאנותרפטיקה מפותחת כדי לטפל במחלות הקשורות למכניקת תאים לא מוסדרת.
- לרוב נדרשים מיקרוסקופים מתקדמים למדידות אלו.
מטרת המחקר
- לפתח שיטות בתפוקה גבוהה למדידת כוחות תאיים.
- לקדם את ההבנה של מכאנוביולוגיה בהקשר של אומיס.
- לחקור את ההשלכות של כוחות מכניים בתהליכים תאיים.
שיטות ששימשו
- מדידת כוחות חוץ-תאיים באמצעות דו-גדילי DNA וחיישנים בצורת סיכה.
- שימוש בחיישנים מקודדים גנטית למדידות תוך-תאיות.
- ניתוח ציטופלומטרי של אוליגונוקלאוטידים פלואורסצנטיים שנקרעו.
- טכניקות בתפוקה גבוהה להערכת כוחות מתיחה תאיים.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של יצירת כוח תאי.
- תובנות לגבי ההיסטוריה המכנית של תאים.
- הדגמה של יישומיות השיטה במכאנופנוטיפינג.
- פוטנציאל לקדם את הפיתוח של מכאנותרפטיקה.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה חדשנית לחקר המכניקה התאית.
- היא משפרת את ההבנה כיצד תאים מתקשרים עם סביבתם.
- מחקר זה עשוי להוביל לאסטרטגיות טיפוליות חדשות המכוונות למכניקת תאים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
High-throughput flow cytometry measurement of cellular mechanotype using DNA tension probes enables scalable quantification of cell-generated forces, addressing a key bottleneck in mechanobiology-driven drug discovery. This approach supports predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for diseases where cell mechanics are disrupted. Integrating force measurement into early discovery pipelines enhances portfolio triage and risk-adjusted advancement decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of cellular force generation as a functional biomarker.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing primary versus secondary effects in disease models.
- Facilitates target validation for mechanotherapeutic strategies by linking force phenotypes to molecular interventions.
Screening & Assay Development
- Provides a high-throughput, flow cytometry-based readout for scalable mechanotype screening.
- Standardizes force measurement across cell types and conditions using DNA tension probes.
- Enables reproducible, quantitative outputs suitable for compound evaluation and assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanotype measurements with disease-relevant cellular phenotypes for translational biomarker development.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling force-based phenotypic screening.
- Improves predictive value for mechanotherapeutic candidate selection in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This method positions cellular force quantification at the intersection of early discovery, lead identification, and preclinical research, enabling mechanotype-based triage and mechanistic insight throughout the pipeline.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on the role of mechanical forces in disease-relevant pathways.
- Screening: Delivers standardized, high-throughput force readouts for compound and genetic perturbation screens.
- Analytics: Provides quantitative, flow cytometry-based measurements for robust statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by linking mechanotype to disease state and therapeutic response.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for force measurement across diverse cell types and experimental systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of mechanotype assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by integrating force phenotyping into early R&D.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mechanotherapeutic programs based on quantitative force data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and DNA probe design for assay setup and data interpretation.
- Needs access to standard flow cytometry instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of gating strategies and negative control thresholds.
- Adaptable to various cell types and experimental conditions with appropriate probe and ligand selection.
- Dependent on robust statistical analysis to distinguish mechanotype shifts across experimental groups.
