Name: אפיון הרכבה עצמית הפיכה תלויה ב-pH של קולואידים זהב מצופים עמילואיד בטא 1-40 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: חקור אפיון הרכבה עצמית הפיכה של קולואידים זהב מצופים Aβ 1-40. השיטה משתמשת בספקטרוסקופיית רמן מחוזקת לזיהוי שינויים קונפורמציונליים בחלבון. המחקר מספק תובנות לגבי דינמיקת הצבירה של Aβ 1-40 ופיתוח טיפולים למחלת אלצהיימר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. הכנת ננו-חלקיקי זהב מצופים Aβ 1-40
<ol>
	<li>הוסף נפח של 1 מ"ל של מים מזוקקים נטולי יונים ל-1 מ"ג של Aβ 1-40 ליופיליזציה (MW: 4.2 kDa, טוהר HPLC 98%) באמצעות מחט מזרק. מערבבים את התמיסה עם מערבל מערבולת למשך כ-30 שניות ומוודאים שלא נצפים חלקיקים מוצקים בתמיסה בטמפרטורת החדר (RT; ~20 מעלות צלזיוס).<ol>
		<li>הכן את כל תמיסות המלאי באמצעות מים דה-יונים ומזוקקים (~18 MΩ·cm).</li>
		<li>זיהוי ספקטרוסקופי של הריכוז על ידי שימוש בספיגת טירוזין ב-275 ננומטר32, שיש לו מקדם הכחדה מולקולריε-275 מתוך 1390 ס"מ-1· מ-1.</li>
		<li>אחסן פתרונות מלאי של Aβ 1-40 ב-80 מעלות צלזיוס. (ראה טבלת חומרים למוצרים המסחריים של Aβ 1-40.)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הפשירו את תמיסת מלאי הפפטידים כ-5 דקות לפני איסוף הנתונים. מערבבים נפח של 8 מיקרוליטר של תמיסת הפפטיד עם 800 מיקרוליטר של חלקיקי זהב קולואידים בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. הוסף נפח של 4.2 מ"ל מים מזוקקים דה-יונים ולאחר מכן מערבולת את הדגימה למשך 10 שניות 30,31,33,34.</li>
	<li>קבע את הריכוז של פפטידים Aβ 1-40 ל -1.8 ננומול וטווח את היחס בין פפטידים Aβ 1-40. מספר הקולואידים של הזהב נע בין ~500:1 ל~2000:125.</li>
</ol>
2. שינוי pH איטרטיבי וניטור שינוי פס SPR מתאים
<ol>
	<li>הגדר את טמפרטורת התמיסה לערך קבוע (למשל, 25 מעלות צלזיוס) באמצעות יחידת בקרת הטמפרטורה של ספקטרופוטומטר אינפרא אדום אולטרה סגול (UV-Vis-NIR).</li>
	<li>עקוב אחר ה-pH הראשוני של תמיסת הדגימה באמצעות מד pH והגדר אותו למעט מתחת ל-pH 7. אסוף את ספקטרום הספיגה בטווח שבין 400 ננומטר ל -1000 ננומטר.</li>
	<li>שנה את ה-pH של הדגימה ל-~pH 4 (כלומר, pH 4.0 ±-0.3) על ידי הוספת נפחי 10 מיקרוליטר של 0.1 M HCl ואסוף את ספקטרום הספיגה בין 400 ננומטר ל-1000 ננומטר.</li>
	<li>שנה את ה-pH של הדגימה ל-~pH 10 (כלומר, pH 10 ±-0.3) על ידי הוספת נפחי 10 מיקרוליטר של 0.1 M NaOH ואסוף את ספקטרום הספיגה בין 400 ננומטר ל-1000 ננומטר.</li>
	<li>שנה את ה-pH בין pH 4 ל-pH 10 עם HCl ו-NaOH 10 פעמים ואסוף את ספקטרום הספיגה ברציפות ב-25 ±-0.2 מעלות צלזיוס29,30. הערה: עבור כל פתרונות הדגימה, הצפיפות האופטית של שיא פס ה-SPR נשמרה סביב 0.2. צפוי אפקט חיץ עקב תמיסת המאגר השיורית בתמיסה. לפיכך, ערך ה-pH הסופי נקבע לאחר אישור שיווי המשקל. ערך ה-pH נמדד ישירות בתא קובטה דגימה באמצעות אלקטרודת מיקרו pH, בעלת דיוק של ±0.005 pH.</li>
	<li>השג את מערך הנתונים של הקוד הסטנדרטי האמריקאי להחלפת מידע (ASCII) של אורכי גל כפונקציה של ספיגה. חלץ את המיקום הממוצע של פסגות הרצועה באמצעות תוכנית Peak Fit .<ol>
		<li>התווה את מערך הנתונים כדי להציג את הצפיפות האופטית כפונקציה של אורך גל (nm) באמצעות הפונקציה Plot .</li>
		<li>סמן אורכי גל שיא התחלתיים λ1, λ2 ו- λ3 על ידי בחירת מיקומם המשוער בנתונים המשורטטים והתאמת הנתונים באמצעות פונקציית RUN .</li>
		<li>השג את הגרף המכיל את השיא המרכזי של כל אחד (λi), XCi, עם השטח של כל פס (Ai).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ייצא את מיקומי השיא והאזורים שחולצו לתוכנית גיליון אלקטרוני וחשב את מיקום השיא הממוצע ב-pH נתון.<ol>
		<li>קבע את גורם השקלול ai של כל מרכז שיא λi על ידי השוואת שטח הרצועה (Ai) לשטח הכולל של כל הרצועות כ: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq01.jpg" style="margin: auto;">.</li>
		<li>חלץ את מיקום השיא הממוצע, <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;"> (pH) באמצעות Eqn. (1). 
		<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq03.jpg" style="margin: auto;">(1)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>צור תרשים הפיכות באמצעות התהליך הבא:<ol>
		<li>טבל את מיקומי השיא הממוצעים, <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;">, כפונקציה של כל מספר "פעולה", n כלעומת <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;"> n. הפוך את מספר הפעולה, n, ל-1 עבור הדגימה לפני הוספת החומצה ב-~pH 7. הגדל את מספר הפעולה ב-1 בכל פעם, שנה את ה-pH ל-~pH4 עם HCl או את ה-pH ל-~pH 10 עם NaOH. הפוך את n למצב חומצי (כלומר, ~pH 4) ואי-זוגי למצב בסיסי (כלומר, pH 10).</li>
		<li>נתח את מיקום השיא בכל n, <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;"> (n) = λ(n), באמצעות הנוסחה30 
		<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq04.jpg" style="margin: auto;">(2) הערה: ייצג מיקום שיא ממוצע התחלתי ב-n = 1 על ידי A. בטא את הפרמטרים B ו-C כשינוי מיקום השיא התלוי ב-n. הפוך את הפרמטר D כמשרעת של גורם השיכוך, E, של חזרה. השתמש בפונקציית הסינוס כדי להציג את הגליות של מיקום השיא כפונקציה של n.</li>
		<li>העבר את מערך הנתונים של (x, y) לתוכנת Origin ושרטוט.</li>
		<li>צור את הפונקציה המותאמת אישית הניתנת ב- Eqn. (2) תחת פונקציית התאמת עקומה לא ליניארית של ניתוח. הקלד את הערכים הראשוניים A, B, C, D ו- E ולחץ על RUN כדי להשלים את ההתאמה.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הדמיית TEM<ol>
		<li>צור את דגימות ה-TEM של קולואידים זהב 20 ננומטר מצופים Aβ 1-40 עם רשתות נחושת מצופות Formvar. בדוק את הדגימות עם TEM המופעל ב-80 קילו וולט.</li>
		<li>אסוף תמונות בהגדלה נומינלית של 28,000x או 71,000x במצלמה דיגיטלית CCD (AMT) של 4 מגה-פיקסל מדגם XR-40. אסוף את תמונות ה-TEM עבור זהב 20 ננומטר מצופה Aβ 1-40 בכל מספר פעולה n = 1 (~pH 7), n = 2, 4, 6, 8 ו-10 (pH 4), ו-n = 3, 5, 7 ו-9 (pH 10).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. הדמיית ראמאן וחקירת הצבירה ההפיכה
<ol>
	<li>הנח 100 מיקרוליטר של תמיסה על דיסק נציץ (קוטר של 1 ס"מ) עבור כל דגימה בפעולה מספר n. דגימות יבשות למשך הלילה לפני המדידה.</li>
	<li>אסוף תמונות אור לבן בכל מספר פעולה n. הכן את הדגימה הנפרדת על דיסק נציץ מכיוון שה-pH השתנה ברציפות בין ~pH 4 ל-~pH 10 עבור כל פעולה מספר n (איור 3).</li>
	<li>אסוף את תמונת ה-Raman בכל מספר פעולה n עם לייזר באורך גל של λ = 633 ננומטר בהספק של 0.5 ± 0.05 mW עם רזולוציה מרחבית של ~0.43 μm ברשת המורכבת מ-100 ×-100 פיקסלים עם זמן אינטגרציה של 500 ms/ספקטרום עבור האזור שבין ~200 ס"מ-1 ל- ~2,800 ס"מ-1 (איור 4).</li>
	<li>שרטט את הספקטרום המייצג עבור כל n מיושר כפונקציה של n ובנה את ספקטרום ה-SERS התלת מימדי כפונקציה של n עבור Aβ1-40 מצופה זהב 20 ננומטר (איור 5A). השתמש בחלק העליון view של ספקטרום ה-SERS התלת מימדי כמפת קווי מתאר (איור 5B) על מנת לחלץ את המצבים הספציפיים הקשורים למצב pH מסוים (כלומר, ~pH 4 ו-~pH 10). חלץ את כל התכונות הספקטרליות המשופרות רק ב-nזוגי או רק ב-nאי-זוגי.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>עמילואיד בטא פפטיד 1-40 (A&beta; <תת>1&ndash; 40 פפטיד)</td><td>r-פפטיד (בוגארט, ג'ורג'יה, ארה"ב)</td><td>A-1156-2</td><td></td></tr><tr><td>CCD מצלמה דיגיטלית</td><td>AMT</td><td>XR-40 4 מגה-פיקסל CCD&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מים מזוקקים נטולי יונים ממערכת המים Milli-Q-</td><td>Millipore Sigma (ברלינגטון, מסצ'וסטס, ארה"ב)</td><td>מקפיא Milli-Q IQ 7000</td><td></td></tr><tr><td>-86 oC</td><td>Thermo Scientific</td><td>Revco Chilly Willy&nbsp; מזהה יחידה מסדרת RLE 187004 מספר build 40.04</td><td></td></tr><tr><td>קולואיד זהב (10 ננומטר)</td><td>Ted Pella, Inc. (רדינג, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>15703-20</td><td></td></tr><tr><td>קולואיד זהב (100 ננומטר)</td><td>Ted Pella, Inc. (רדינג, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>15711-22</td><td></td></tr><tr><td>קולואיד זהב (15 ננומטר)</td><td>Ted Pella, Inc. (רדינג, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>15704-20</td><td></td></tr><tr><td>קולואיד זהב (20 ננומטר)</td><td>Ted Pella, Inc. (רדינג, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>15705-20</td><td></td></tr><tr><td>קולואיד זהב (30 ננומטר)</td><td>טד פלה בע"מ (רדינג, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>15706-21</td><td></td></tr><tr><td>קולואיד זהב (40 ננומטר)</td><td>טד פלה בע"מ (רדינג, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>15707-21</td><td></td></tr><tr><td>קולואיד זהב (50 ננומטר)</td><td>טד פלה בע"מ (רדינג, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>15708-21</td><td></td></tr><tr><td>קולואיד זהב (60 ננומטר)</td><td>טד פלה בע"מ (רדינג, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>15709-22</td><td></td></tr><tr><td>קולואיד זהב (80 ננומטר)</td><td>Ted Pella, Inc. (רדינג, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>15710-22</td><td></td></tr><tr><td>דיסקי נציץ V1AFM בדרגה הגבוהה ביותר 10 מ"מ</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>#50</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה סטנדרטית של חומצה הידרוכלורית, 1.0 N</td><td>Fluka</td><td>Lot # SHBB4705V&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 318949-2L</td><td></td></tr><tr><td>מאקרו קוורץ קובט נתיב אור 10 מ"מ</td><td>מדע זבוב האש&nbsp;</td><td>אלקטרודה מיקרו pH מסוג 1-MC-Path10 מ"מ</td><td></td></tr><tr><td></td><td>HORIBA</td><td>דגם 9618S (MFG מס' 9Y8E0050)</td><td></td></tr><tr>מקור <td>תוכנית Peak Fit</td><td>(נורת'המפטון, מסצ'וסטס, ארה"ב)</td><td>OriginPro2018b (64 סיביות) b9.5.5.409 (אקדמי)</td><td></td></tr><tr><td>pH 4.00 תמיסת חיץ&nbsp;</td><td>VWR</td><td>Cat מס' 34170-127</td><td></td></tr><tr><td>pH 7.00 תמיסת חיץ&nbsp;</td><td>פישר כימיקל</td><td>SB107-4 לוט 191041</td><td></td></tr><tr><td>מד pH</td><td>HORIBA</td><td>דגם F-72G (MFG מס' B27M0017)</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לפיפט &nbsp; טיפים מקסי 1&ndash; 5 מ"ל</td><td>פישר&nbsp; &nbsp;</td><td>02-707-467</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לפיפט 10 מ"ל</td><td>פישר</td><td>02-717-135</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לפיפט 1000 מ"ל</td><td>פישר</td><td>02-717-156</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לפיפט 1&ndash; 200 מ"ל</td><td>פישר</td><td>02-717-143</td><td></td></tr><tr><td>פיפטר פישר מותג עלית 0.5&ndash; 5 מ"ל</td><td>פישר</td><td>QU05317</td><td></td></tr><tr><td>פיפטר פישר מותג עלית 100&ndash; 1000 מ"ל</td><td>פישר</td><td>QU01672</td><td></td></tr><tr><td>פיפטר פישר מותג עלית 10&ndash; 100 מ"ל</td><td>פישר</td><td>MU10985</td><td></td></tr><tr><td>פיפטר פישר מותג עלית 1&ndash; 10 מ"ל</td><td>פישר</td><td>MU08178</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת נתרן הידרוקסיד 1.0 מ</td><td>'פלוקה</td><td>לוט#05096BPV&nbsp; &nbsp; 319511-2L</td><td></td></tr><tr><td>TEM</td><td>FEI Co</td><td>Morgagni דגם 268&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>צינורות PCR של TempAssure, כובעים שטוחים, טבעי&nbsp;</td>פוליפרופילן מדעי <td></td><td>בארה"ב</td><td>. 0.2 מ"ל צינורות בודדים בעלי דופן דקה עם כובעים שטוחים חלביים מחוברים</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר UV-Vis-NIR</td><td>Varian</td><td>CARY 5000 UV1106M074</td><td></td></tr><tr><td>WI Tec alpha300R מיקרוסקופ רמאן קונפוקלי</td><td>WITec-Oxford Instrument</td><td>XMB3000-3001</td><td></td></tr></tbody></table>

אפיון הרכבה עצמית הפיכה תלויה ב-ph של קולואידים זהב מצופים עמילואיד בטא 1-40

Characterization of pH-Dependent Reversible Self-Assembly of Amyloid Beta 1-40-Coated Gold Colloids

עם ההצמדה של Aβ 1-40 על פני השטח של חלקיקי הזהב הננו-קולואידים, פס ה-SPR סביב מקסימום הספיגה של 530 ננומטר הוסט באופן משמעותי לאדום למצב שיא של ~650 ננומטר כאשר התמיסה נעשתה חומצית יותר (pH 4)35. יחד עם תמונות TEM, זיהינו כי מאפיינים ספקטרוסקופיים שנצפו ב-pH 4 תואמים להיווצרות אגרגטים קולואידים של זהב עם קונפורמציה פרושה סבירה ורשת עם מונומרים Aβ 1-40 שנפרשו מסביב הנספגים על פני הזהב30. ראינו כי המונומרים Aβ 1-40 מתהפכים בחזרה לקונפורמציה המקופלת בתנאים בסיסיים (pH 10), וכתוצאה מכך עיוות של האגרגטים בצורה כמעט הפיכה. תהליך כמעט-הפיך זה ניכר מהחלפת שיא הפס הממוצע (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;">(n)), שנע בין אורך גל קצר לארוך יותר, והמורפולוגיה המפוזרת לעומת המצטברת בתמונות TEM בין תנאים בסיסיים (pH = 10) וחומציים (pH = 4). נצפה בעבר שחלק ממונומר Aβ 1-40 נשאר פרוש גם לאחר שהתמיסה הוחזרה לתנאים בסיסיים36. סרטון 1 מציג את שינוי הצבע התלוי ב-pH של Aβ 1-40 וקולואיד זהב חשוף של 20 ננומטר.
לשם השוואה, נערכה חקירת כשות pH של קולואיד זהב חשוף של 20 ננומטר (איור 5C ו-D). ככל שפעולת שינוי ה-pH התקדמה, היא הראתה את צמיחת האשכולות של קולואידים הזהב ב-SPR band shoft, תמונות TEM כמו גם תמונות אור לבן. באופן מעניין למדי, היו כמה קווים ספקטרליים של SERS התלויים ב-nאי-זוגי ו-nזוגי. לדוגמה, ב-nזוגי (pH ~4), הקו ב-275 ס"מ-1, שהוקצה כמצב הקשור ל-Aun (n = 5, 6, 12, 16, 20, 58)37 או מצב של Au-Cl-ligand38 נצפה באופן אינטנסיבי. מצד שני, עבור nזוגי, ב-1008 ס"מ-1 נצפה str39 ו-CH2 wag39, עיוות CH2 40 נצפו בהרחבה ב-1291 ס"מ-1.
בניגוד למורפולוגיה הברורה של צבירה תלוית pH והפיכה שנצפתה על ידי הדמיית אור לבן, היו הבדלים עדינים יחסית בתכונות הספקטרליות בספקטרום SERS בין nodd ל-nזוגי. כקירוב ראשון, צפיפות הקו הספקטרלי באזור שבין 250 ס"מ-1 ל-1750 ס"מ-1 הייתה גבוהה יותר עבור nאי-זוגי מאשר nזוגי. הקווים הספקטרליים באזור טביעות האצבע, 1250 ס"מ-1 ו-1750 ס"מ-1 (רצועות אמיד I, II ו-III ) עבור nאי-זוגי הראו מאפיינים ספקטרליים פחות פתורים, מה שמרמז על התרחבות או עלייה בצפיפות הספקטרלית. באיור 6, מפת קווי מתאר הניתנת באיור 5B (איור 6B) אורגנה עם אותות SERS ב-761 ס"מ-1 (אדום) ו-1395 ס"מ-1 (כחול), המייצגים את הדגשים ב-nאי-זוגי ו-nזוגי, בהתאמה (איור 6C). כספקטרום SERS מייצג עבור nאי-זוגי ו-nזוגי, ספקטרום SERS ב-n = 7 (אדום) ו-n = 4 (כחול) מוצגים בחלק העליון (איור 6A). על מנת להראות את ההתאמה להיסט פס ה-SPR עבור זהב מצופה Aβ1-40 20 ננומטר, תרשים היסט הפס באיור 3 מוצג בצד (איור 6D).
בעוד שיש לנו נתונים ראשוניים על ההקצאה המלאה של ספקטרום ה-SERS הנצפה, אנו מציינים כאן כמה תכונות בולטות של היסט ראמאן. הקווים הספקטרליים ו(ההקצאות הסבירות) המוגדרים ב-n אי-זוגי הם בעיקר באזור הנמוך מ-1000 ס"מ-1: 394 ס"מ-1 (Trp)41,42,43, 761 ס"מ-1 (שלו, אלא)39,44,45,46,47, 875 ס"מ-1 (תזוזה אינדולית NH, מתיחת C-C של Met)39, 974 ס"מ-1 (Glu, C-COO- מתיחה של Asp, מצב הקשור לציטראט)39,48,49. היסט הרמאן המשופר ב-nאפילו הראה מאפיינים ספקטרוסקופיים משמעותיים באזור טביעות האצבע (אמיד I, II ו-III): 1166 ס"מ-1 (עיוות N-H+ של טיר)39,41, 1227 ס"מ-1 (Ala-Pro-Gly, Amide III)39,50,51, 1395 ס"מ-1 (COO- מתיחה סימטרית או CH2- CH3- מספריים של Glu)39,48, 1585 ס"מ-1 (מתיחת טבעת CC של Phe, מתיחה אסימטרית של קרבוקסילט -Au, COO- מתיחה של ציטראט, עיוות של טבעת בנזן)39,41,45,46,47,49,52, 1592 ס"מ-1 (מתיחת Phe, Tyr, C=C של Tyr, מתיחת CC של הטבעת ב-Phe, מתיחת טבעת בנזן ו-COO- מתיחה ב-Phe ו-Tyr, ומתיחה אסימטרית של OH)39,41,48,50,51 ו-1628 ס"מ-1 (תת-שיא אמיד I ייחודי למבני β גיליונות בין-מולקולריים 53, C=O ומצבי הרטט המצומדים CN/NH של עמוד השדרה של החלבון שמקורם במבנים מקבילים מסוג β גיליון, הצטברות של Aβ54 מצטבר, סלילים אקראיים, β סיבובים, β סיכות שיער48. הרצפים המופיעים עבור nאי-זוגי או nזוגי מוצגים באיור 7. בסך הכל, עבור nאפילו המקביל לצבירה הפיכה או קונפורמציה פרושה של Aβ 1-40, Phe/Tyr המכיל טבעת בנזן, מתיחה סימטרית של מצב מספריים COO-, CH2- CH3- של Glu, ועיוות -NH+ של Tyr היו מעורבים באופן משמעותי בשינוי הקונפורמציה של הפפטיד. במהלך פירוק הצבירה שנצפתה כאשר פפטידים אימצו את הקונפורמציה המקופלת המתאימה למצבים הבולטים ב-nodd, נראה כי Glu, Asp, Met, His ו-Ala היו מעורבים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig01.jpg"> 
איור 1: הספיגה והמורפולוגיה התלויה ב-pH. ספקטרום הספיגה ב-pH 4 (A) ו-pH 10 (B) עבור ננו-חלקיקי זהב מצופים Aβ 1-40 (20 ננומטר), ותמונות ה-TEM המתאימות, סקיצות של חלקיקים מצטברים/מפוזרים ותמונות של תמיסות בבקבוקונים. A הוא הקונפורמציה הפרושה של מונומרים Aβ 1-40 בתנאים חומציים, ו-B הוא הקונפורמציה המקופלת בתנאים בסיסיים. דיאגרמות של מונומרים Aβ 1-40 בכל קונפורמציה ומורפולוגיה של אגרגציה/פיזור מוצגות ליד תמונות TEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig02.jpg"> 
איור 2: הפיכות הרכבה-עצמית תלויה בגודל ננו. השינוי של מיקום השיא הממוצע של רצועת ה- SPR, <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;">, כפונקציה של מספר הפעולה, n, עבור כל הגדלים שנבדקו של חלקיקי קולואיד זהב. ערכי ה-pH המשוערים והשלב המקביל של האגרגטים המוצגים באיור 1 ניתנים גם כן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig03v2.jpg"> 
איור 3: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq05.jpg" style="margin: auto;"> ותמונות TEM/אור לבן בכל מספר פעולה. כפונקציה של מספר הפעולה<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;">, n, שורטט יחד עבור Aβ 1-40 מצופה זהב 20 ננומטר (עיגולים סגורים) וקולואיד זהב 20 ננומטר (עיגולים פתוחים) ומוצג עם תמונות TEM מייצגות (A ו-C)/אור לבן (B ו-D) במספרי פעולה נבחרים (n = 1, 2, 3, 7 ו-8 המסומנים על ידי חיצים מפוענחים) עבור Aβ1-40 מצופה זהב 20 ננומטר (A ו-B) וקולואיד זהב 20 ננומטר (C ו-D). גופן שחור מציין pH 7, גופן כחול מציין pH 4 וגופן אדום מציין pH 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig04.jpg"> 
איור 4: אור לבן מייצג ותמונת ראמאן. תמונת האור הלבן, תמונת רמאן וספקטרום SERS עבור (A) n = 2 ו- (B) n = 3; i) תמונת אור לבן בשדה ראייה רחב, ii) תמונת אור לבן באזור בו נאספה תמונת Raman (מסומנת על ידי ריבוע אדום ב-i)), iii) תמונת Raman של שני רכיבים משולבים, iv) תמונת Raman של רכיב 1 ו-v) ספקטרום SERS של iv), vi) תמונת Raman של רכיב 2, ו-vii) ספקטרום SERS של vi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig05.jpg"> 
איור 5: מפת קווי המתאר של ספקטרום SERS עבור nאי-זוגי, nזוגי ו-nall. (A) המפה התלת-ממדית של ספקטרום SERS באזור של 250 ס"מ-1 ו-1750 ס"מ-1 כפונקציה של n עבור Aβ1-40 מצופה זהב 20 ננומטר עם מפת קווי מתאר המוצגת ב-(B) בחלק העליון. (C) המפה התלת-ממדית של ספקטרום SERS באזור של 250 ס"מ-1 ו-1750 ס"מ-1 כפונקציה של n עבור זהב 20 ננומטר עם מפת קווי מתאר המוצגת ב-(D) בחלק העליון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig06v2.jpg"> 
איור 6: מפת קווי המתאר של ספקטרום SERS. מפת קווי המתאר של ספקטרום SERS כפונקציה של n (1-10). (A) ספיגה ב-1395 ס"מ-1 (כחול) ו-761 ס"מ-1 (אדום). (ב-ד) הפאנל התחתון מציג את ספקטרום SERS והפאנל הימני מציג את משרעת שינוי עוצמת האות של אותות SERS בכל n. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig06largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig07v3.jpg"> 
איור 7: רצפים בולטים של Aβ1-40. הרצפים שהוקצו למעורבות משמעותית ב-nodd (המתאים להיווצרות קונפורמציה מקופלת) מסומנים על ידי חיצים אדומים כלפי מטה, ואלה שהוקצו למעורבות משמעותית ב-nזוגי (המתאים להיווצרות קונפורמציה פרושה) מסומנים על ידי חיצים כחולים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig07largev3.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
סרטון 1: שינוי צבע תלוי pH של Aβ1-40 וקולואיד זהב חשוף של 20 ננומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/Movie%20Abeta-Gold%20Color%20Change.wmv" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.</a>

אפיון הרכבה עצמית הפיכה תלויה ב-pH של קולואידים זהב מצופים עמילואיד בטא 1-40

The characterization of A&#946;1-40 coated over the nano-gold colloidal particle surfaces was conducted using surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy ...

characterization-ph-dependent-reversible-self-assembly-amyloid-beta-1

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

תמונה-Induced cross-linking של חלבונים ללא שינוי (PICUP) מאפשר אפיון של התפלגות גודל oligomer תערובות חלבון metastable. אנו מדגימים יישום PICUP שלושה פפטידים נציג amyloidogenic 40 - ו 42-שאריות צורות של עמילואיד β-חלבון, קלציטונין ו פפטיד לשלוט הורמון גדילה גורם משחרר.

תמונה-induced cross-linking של חלבונים ללא שינוי (PICUP) יישומית כדי פפטידים Amyloidogenic

Aptamers הם ribo-/deoxyribo-oligonucleotides קצר נבחר על...

מבחר Aptamers עבור חלבון β עמילואיד, הסוכן סיבתי של מחלת אלצהיימר

שיטה לטיהור בקנה מידה גדולה של התחום התאי APP (AICD) מתוארת. גם אנו מתארים שיטה כדי...

טיהור וצבירה של תחום החלבון המבשר עמילואיד התאי

חלבונים יכולים לאמץ מבנה מקורי או להתקפל בצורה לא נכונה לעמילואיד בלתי מסיס. תנאים המעדיפים את מסלול הקיפול הלא נכון מובילים להיווצרות סוגים שונים של סיבי עמילואיד. השיטות המתוארות כאן מאפשרות המרה מהירה של חלבונים מקומיים לעמילואיד במבחנה.

דור מהיר של עמילואיד מחלבונים שפת אם<em&gt; במבחנה</em

בזאת אנו מדווחים על פרוטוקול טיהור HPLC המותאמים כי התשואות בטא עמילואיד טוהר גבוהה 42 (Aβ42) ו עמילואיד בטא 40 (Aβ40) פפטידים, מסוגל היווצרות oligomer. בטא עמילואיד הוא פפטיד צבירה נוטה, הידרופובי מאוד מעורב מחלת אלצהיימר. אופי amyloidogenic של הפפטיד עושה הטיהור שלה אתגר.

פרוטוקול טיהור HPLC המותאמים כי תשואות גבוהות טוהר עמילואיד בטא 42 ו עמילואיד בטא 40 פפטידים, מסוגל גיבוש oligomer

פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין oligomers Aβ פפטיד סינתטי במבחנה וכן להעריך כמויות יחסיות של אוליגומר Aβ על ידי נקודה סופג ניתוח.

הכנה A11-חיוביות β-עמילואיד אוליגומר והערכה באמצעות נקודה סופג ניתוח

פרוטוקול לסינתזה של 1, 2-dithiolane ששינה פפטיד ואפיון המבנים סופרא מולקולרית הנובע פפטיד הרכבה עצמית.

סינתזה ואפיון של 1, 2-Dithiolane ששינה פפטידים וההספק עצמית

להלן מוצגות שתי שיטות שבהן ניתן להשתמש בנפרד או במשולב כדי לנתח את השפעת בטא עמילואיד על מבנה קריש פיברין. כלול הוא פרוטוקול עבור יצירה של במבחנה clot פיברין, ואחריו קריש עכירות ואלקטרון סריקה שיטות.

ניתוח של β-עמילואיד-induced הפרעות על מבנה קריש פיברין על ידי ספקטרוסקופיה וסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים

שיטת טיהור ביוכימית זו עם ניתוח פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסה מאפשרת אפיון חזק של ליבות פיבריל עמילואידיות, מה שעשוי להאיץ את זיהוי המטרות למניעת מחלת אלצהיימר.

טיהור ביוכימי ואפיון פרוטאומי של ליבות פיבריל עמילואידיות מהמוח

סיבי עמילואיד נוצרים על ידי חלבונים רבים, והסיבים המתקבלים חולקים מבנה "β-יריעה". כאן אנו מתארים כיצד ניתן להכין דגימות סיבים אמילואידיים לדיפרקציה של סיבי רנטגן וכיצד ניתן לנתח את הדפוסים.

אמילואיד והארכיטקטורה החוצה-בטא

חקור אפיון הרכבה עצמית הפיכה של קולואידים זהב מצופים Aβ 1-40. השיטה משתמשת בספקטרוסקופיית רמן מחוזקת לזיהוי שינויים קונפורמציונליים בחלבון. המחקר מספק תובנות לגבי דינמיקת הצבירה של Aβ 1-40 ופיתוח טיפולים למחלת אלצהיימר.

אפיון הרכבה עצמית הפיכה תלויה ב-pH של קולואידים זהב מצופים עמילואיד בטא 1-40

גלה סרטונים נוספים