Name: שימוש במכלול In Vivo לבניית פלסמיד ביעילות גבוהה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: למדו שיטת הרכבה בתוך תאים (IVA) לשיבוץ DNA ביעילות גבוהה עד 99% באמצעות אנזימי תיקון DNA טבעיים בחיידקי E. coli. שיטה זו מייעלת מחקר בחלבונים חיידקיים ובהנדסה גנטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Bertero, A., Brown, S., Vallier, L. Methods of cloning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBertero%2C+A+%22Basic+Science+Methods+for+Clinical+Researchers%22">Basic Science Methods for Clinical Researchers</a>. Chapter 2, Academic Press. 19-39 (2017).</li>
<li>Garcia-Nafria, J., Watson, J. F., Greger, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IVA+cloning%3A+A+single-tube+universal+cloning+system+exploiting+bacterial+in+vivo+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">IVA cloning: A single-tube universal cloning system exploiting bacterial in vivo assembly.</a> Sci Rep. 6, 27459(2016).</li>
<li>Bubeck, P., Winkler, M., Bautsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cloning+by+homologous+recombination+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid cloning by homologous recombination in vivo.</a> Nucleic Acids Res. 21 (15), 3601-3602 (1993).</li>
<li>Avilan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembling+multiple+fragments%3A+the+Gibson+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembling multiple fragments: the Gibson assembly.</a> Methods Mol Biol. 2633, 45-53 (2023).</li>
<li>Stukenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Marburg+Collection%3A+A+Golden+Gate+DNA+assembly+framework+for+synthetic+biology+applications+in+Vibrio+natriegens%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">The Marburg Collection: A Golden Gate DNA assembly framework for synthetic biology applications in Vibrio natriegens.</a> ACS Synth Biol. 10 (8), 1904-1919 (2021).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Engler, C., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golden+Gate+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Golden Gate cloning.</a> Methods Mol Biol. 1116, 119-131 (2014).</li>
<li>Ma, H., Kunes, S., Schatz, P. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+construction+by+homologous+recombination+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Plasmid construction by homologous recombination in yeast.</a> Gene. 58 (2-3), 201-216 (1987).</li>
<li>Cao, P., Wang, L., Zhou, G., Wang, Y., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+assembly+of+multiple+DNA+fragments+through+direct+transformation+of+PCR+products+into+E.+coli+and+Lactobacillus%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Rapid assembly of multiple DNA fragments through direct transformation of PCR products into E. coli and Lactobacillus.</a> Plasmid. 76, 40-46 (2014).</li>
<li>Conley, E. C., Saunders, V. A., Saunders, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+and+rearrangement+of+plasmid+DNA+during+transformation+of+Escherichia+coli+with+linear+plasmid+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Deletion and rearrangement of plasmid DNA during transformation of Escherichia coli with linear plasmid molecules.</a> Nucleic Acids Res. 14 (22), 8905-8917 (1986).</li>
<li>Conley, E. C., Saunders, V. A., Jackson, V., Saunders, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+intramolecular+recyclization+and+deletion+formation+following+transformation+of+Escherichia+coli+with+linearized+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanism of intramolecular recyclization and deletion formation following transformation of Escherichia coli with linearized plasmid DNA.</a> Nucleic Acids Res. 14 (22), 8919-8932 (1986).</li>
<li>Sung, W. L., Zahab, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+recombination+directed+by+single-stranded+crossover+linkers%3A+specific+deletion+of+the+amino-terminal+region+of+the+beta-galactosidase+gene+in+pUC+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22DNA%22%5BJournal%5D)">Site-specific recombination directed by single-stranded crossover linkers: specific deletion of the amino-terminal region of the beta-galactosidase gene in pUC plasmids.</a> DNA. 6 (4), 373-379 (1987).</li>
<li>Mandecki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-directed+double-strand+break+repair+in+plasmids+of+Escherichia+coli%3A+a+method+for+site-specific+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 83 (19), 7177-7181 (1986).</li>
<li>Jones, D. H., Howard, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+recombination+and+site-specific+mutagenesis+by+placing+homologous+ends+on+DNA+using+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A rapid method for recombination and site-specific mutagenesis by placing homologous ends on DNA using polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 10 (1), 62-66 (1991).</li>
<li>Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+should+be+simple%3A+Escherichia+coli+DH5alpha-mediated+assembly+of+multiple+DNA+fragments+with+short+end+homologies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cloning should be simple: Escherichia coli DH5alpha-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies.</a> PLoS One. 10 (9), e0137466(2015).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+plasmid+cloning+with+a+universal+MCS+design+and+bacterial+in+vivo+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Simplified plasmid cloning with a universal MCS design and bacterial in vivo assembly.</a> BMC Biotechnol. 21 (1), 24(2021).</li>
<li>Braun, H. G., Kanwal, N., Rivera Lopez, L. F., Thomassin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+plasmid+series+for+rapid+sub-cloning+and+use+in+various+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Generation of a plasmid series for rapid sub-cloning and use in various Enterobacteriaceae.</a> J Biosci Bioeng. 138 (6), 478-487 (2024).</li>
<li>Kibbe, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OligoCalc%3A+an+online+oligonucleotide+properties+calculator%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator.</a> Nucleic Acids Res. 35 (Web Server issue), W43-W46 (2007).</li>
<li>Wallace, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridization+of+synthetic+oligodeoxyribonucleotides+to+phi+chi+174+DNA%3A+the+effect+of+single+base+pair+mismatch%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to phi chi 174 DNA: the effect of single base pair mismatch.</a> Nucleic Acids Res. 6 (11), 3543-3557 (1979).</li>
<li>Bzymek, M., Lovett, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+of+repetitive+DNA+sequences%3A+The+role+of+replication+in+multiple+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Instability of repetitive DNA sequences: The role of replication in multiple mechanisms.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (15), 8319-8325 (2001).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inoue+method+for+preparation+and+transformation+of+competent+E.+coli%3A+%26%2334%3Bultra-competent%26%2334%3B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">The inoue method for preparation and transformation of competent E. coli: &#34;ultra-competent&#34; cells.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J Vis Exp. (6), e253(2007).</li>
<li>Fürste, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+the+plasmid+RP4+primase+region+in+a+multi-host-range+tacP+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of the plasmid RP4 primase region in a multi-host-range tacP expression vector.</a> Gene. 48 (1), 119-131 (1986).</li>
<li>Bäumler, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+iron+regulated+locus+of+Salmonella+typhi%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Identification of a new iron regulated locus of Salmonella typhi.</a> Gene. 183 (1-2), 207-213 (1996).</li>
<li>Godiska, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+plasmid+vector+for+cloning+of+repetitive+or+unstable+sequences+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Linear plasmid vector for cloning of repetitive or unstable sequences in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 38 (6), e88(2010).</li>
<li>Watson, J. F., Garcia-Nafria, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+DNA+assembly+using+common+laboratory+bacteria%3A+A+re-emerging+tool+to+simplify+molecular+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo DNA assembly using common laboratory bacteria: A re-emerging tool to simplify molecular cloning.</a> J Biol Chem. 294 (42), 15271-15281 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 kb פלוס סולם DNA</td><td>FroggaBio</td><td>DM015-R500</td><td>סמן משקל מולקולרי DNA</td></tr><tr><td>AccuReady M ערוץ יחיד 0.5-10 ומיקרו; L</td><td>בולדוג ביו</td><td>BPP020</td><td>פיפטות להעברת נוזל</td></tr><tr><td>AccuReady M ערכת פיפטור חד ערוץ</td><td>בולדוג ביו</td><td>BPK100</td><td>פיפטות להעברת נוזל</td></tr><tr><td>אגר</td><td>ביושופ קנדה</td><td>AGR003.1</td><td>חומר ממצק למדיום גידול</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biobasic</td><td>D0012</td><td>הכינו ג'לי אגרוז לאלקטרופורזה של DNA</td></tr><tr><td>ביומטרה&nbsp;</td><td>Analytikjena</td><td>846-2-070-301</td> כובעי <td>תרמו-ציקלר</td></tr><tr><td>לצינורות תרבית זכוכית</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-957-91</td><td>כובעים לשימוש חוזר לצינורות תרבית זכוכית</td></tr><tr><td>פריימרים DNA</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>N/A</td><td>לקשור ולהגביר DNA תבנית בתגובת PCR</td></tr><tr><td>DpnI&nbsp;</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0176S</td><td>לבקע תבנית מתילציה DNA בעקבות הגברת PCR</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R3101L</td><td>אנזים הגבלה, מגיע עם מאגר מתאים</td></tr><tr><td>מיקרו-צינורות אפנדורף 1.5 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.300</td><td>מיקרו-צינור, 1.5 מ"ל, בסיס חרוטי, PP, מכסה שטוח מחובר, סיומים יצוקים וחלל כתיבה חלבי</td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td></td><td>AAL0748203 חומר הדמיה/אינטרקלציה של DNA,</td></tr><tr><td>ערכת מיני-הכנה רעילה EZ-10 עמודת ספין פלסמיד DNA</td><td>ביו-בייסיק</td><td>BS614</td><td>בידוד DNA פלסמיד מתרביות חיידקים לילה</td></tr><tr><td>מערכת GelDoc Go-Gel</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>12009077 הדמיית DNA ג'לים צינורות</td></tr><tr><td>תרבית זכוכית</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-925E</td><td>צינורות תרבית זכוכית</td></tr><tr><td>myGel&nbsp; מערכת מיני אלקטרופורזה</td><td>מערכת Z742288 Sigma-Aldrich</td><td></td><td>המשמשת לאלקטרופורזה ג'ל</td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td>קביעת ריכוז DNA</td></tr><tr><td>ניקוי PCR לריצוף DNA</td><td>ביו-בייסיק</td><td>BT5100</td><td>טיהור מוצרי PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.011</td><td>צלחת פטרי 92 x 16 מ"מ, PS, שקופה, עם מצלמות אוורור</td></tr><tr><td>קצה פיפטה, 1000 ומיקרו; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.305</td><td>קצות פיפטה ל 100-1000 ומיקרו; </td></tr><tr><td>L קצה פיפטה, 2.5 ומיקרו; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.3010.265</td><td>קצות פיפטה עד 2.5 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>קצה פיפטה, 20 ומיקרו; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.3020.200</td><td>קצות פיפטה עד 20 ומיקרו; </td></tr><tr><td>L קצה פיפטה, 200 ומיקרו; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.3030.020</td><td>טיפים לפיפטה עבור 1-200 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>מלח (NaCl)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S271-10</td><td>רכיב של מדיום גידול חיידקים (10 גרם/ליטר)</td></tr><tr><td>צינורות PCR בודדים של 0.2 מ"ל עם מכסה שטוח</td><td>צינורות FroggaBio</td><td>TF-1000</td><td>PCR</td></tr><tr><td>טריפטון (בקטריולוגי)</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP402.5</td><td>רכיב של מדיום גידול חיידקים (10 גרם/ליטר)</td></tr><tr><td>VeriFi DNA פולימראז</td><td>PCR Biosystems</td><td>PB10.42-01</td><td>פולימראז בנאמנות גבוהה, מאגר ה-PCR המכיל Mg2+ ו-dNTPs מסופק עם רכישה</td></tr><tr><td>Xba I</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0145S</td><td>אנזים הגבלה, מגיע עם</td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td> מתאימה <td>BioShop Canada</td><td>YEX401.205</td><td>רכיב של מדיום גידול חיידקים (5 גרם/ליטר)</td></tr></tbody></table>

שימוש במכלול in vivo לבניית פלסמיד ביעילות גבוהה

Use of In Vivo Assembly for High-efficiency Plasmid Construction

בכתב יד זה, כדוגמה לשימוש ב-IVA, עקבנו אחר זרימת העבודה של IVA שסופקה כדי לשכפל מחדש את מסגרת הקריאה הפתוחה של mCherry לאתר השיבוט המרובה של פלסמיד pSU19 כדי ליצור פלסמיד זהה ל-pSU19mCherry (איור 3)17. פריימרים המתאימים ל-IVA תוכננו על סמך שלבי פרוטוקול 1.1 ו-1.2. לאחר מכן, נעשה שימוש בערכת בידוד פלסמיד לבידוד pSU19 ו-pSU18mCherry, ששימשו כתבניות לתגובות PCR כדי להגביר את עמוד השדרה של הפלסמיד ולהכניס DNA, בהתאמה (שלב פרוטוקול 2.1). עמוד השדרה של הפלסמיד pSU19 הוגבר ב...

שימוש במכלול In Vivo לבניית פלסמיד ביעילות גבוהה

In vivo assembly (IVA) is a molecular cloning method that uses intrinsic enzymes present in bacteria that promote intermolecular recombination of DNA ...

use-of-in-vivo-assembly-for-high-efficiency-plasmid-construction

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

שיטה מהירה ויעילה לשלב דנ"א זר של עניין תוך מוכנות זנים נוטלים, המכונות משטח נחיתה זנים, מתואר. השיטה מאפשרת לאתר ספציפי לשילוב של הקלטת ה-DNA לתוך לוקוס משטח מהונדסים הנחיתה של זן מסוים, דרך הצמידה וביטוי integrase ΦC31.

אתר ספציפי הנדסה כרומוזום בקטריאלי: ΦC31 מתווכת integrase קלטת Exchange (IMCE)

מקור: Tomás, J. M., et al. יצירת מוטציות אפס כדי להבהיר את תפקידם של גליקוזילטרנספראזות חיידקיות בתנועתיות חיידקים. J. Vis. Exp. (2022).סרטון זה מדגים את ההגברה התלויה ביוזם של פלסמיד מתאבד ב - E. coli. הפלסמיד, הנושא גן עמידות לאנטיביוטיקה, משתכפל רק בנוכחות חלבון יוזם המקודד על ידי המארח. לאחר אלקטרופורציה ודגירה במדיום התאוששות, התערובת מצופה על אגר המכיל אנטיביוטיקה. חיידקים עם פלסמיד שורדים, מכיוון שהחלבון היוזם שלו מאפשר ביטוי של הגן העמיד לאנטיביוטיקה של הפלסמיד.

הגברה של פלסמיד מתאבד במארח חיידקים

ניתן להשתמש במתודולוגיות מיקוד גנים כדי ליצור עכברים טרנסגניים עם אללים נוק-אאוט, נוק-אין ומתויגים.  כאן, אנו מתארים שיטה משופרת של קומבינר מחדש ב-E. coli, שאנו מכנים 'תת-שיבוט פלוס הכנסה', שניתן להשתמש בה כדי ליצור וקטורים מכוונים לגנים מותאמים אישית במהירות.

Subcloning Plus ההכנסה (SPI) - Recombineering שיטה חדשה לבנייה המהירה של וקטורי גן המיקוד

סינתזה של פלסמידים מותאמים אישית גוזלת עבודה וזמן. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בשיבוט הרכבה של גיבסון כדי להפחית את העבודה ומשך הליך שיבוט ה-DNA המותאם אישית. הפרוטוקול המתואר מייצר גם מבני חלבון מתויגים אמינים לביטוי יונקים בעלות דומה לשיבוט ה-DNA המסורתי של גזירה והדבקה.

דור של פלסמיד וקטורים לבטא חלבונים מתויג FLAG על פי תקנות ההסדרה של יזם אדם התארכות Factor-1α שימוש גיבסון עצרת

תחומים אבץ אצבע הם מיסוד תא חדיר ומסוגל תיווך משלוח חלבון למגוון רחב של סוגי יונקים תא. כאן, פרוטוקול צעד-אחר-צעד מפורט ליישום טכנולוגית אבץ-אצבע למסירת חלבון תאית מוצג.

משלוח חלבון ישיר לשימוש בתאי יונקי Cys Cell-חדיר<sub&gt; 2</sub&gt; כלי-<sub&gt; 2</sub&gt; Domains אבץ האצבע

כאן, אנו מציגים כימרה הרכבה על ידי התאוששות פלסמיד והגבלת אנזים האתר הכניסה (CAPRRESI), פרוטוקול המבוסס על החדרת אתרי אנזים הגבלה לתוך רצפי DNA נרדף התאוששות פלסמיד פונקציונלי. פרוטוקול זה הוא שיטה מהירה בעלות נמוכה עבור מיזוג גנים מקודדים חלבונים.

CAPRRESI: כימרה האסיפה על ידי פלסמיד השחזור והגבלת אנזים האתר הכנס

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול כדי לייצר כמויות גדולות של רנ א רקומביננטי ב- Escherichia coli בהבעת משותפת של RNA chimeric המכיל את הרנ א ביקוש לפיגום וירואיד ומפעל ליגאז tRNA. המוצר העיקרי הוא מולקולה מעגלית המקל על טיהור עד הומוגניות.

ייצור בקנה מידה גדול של RNAs רקומביננטי על גרדום מעגלית באמצעות מערכת נגזר וירואיד ב- Escherichia coli

מטרת פרוטוקול זה היא לספק מדריך מפורט, צעד אחר צעד להרכבת מבנים מרובי גנים באמצעות מערכת שיבוט מודולרית המבוססת על שיבוט שער הזהב. הוא גם נותן המלצות על צעדים קריטיים כדי להבטיח הרכבה אופטימלית המבוססת על החוויות שלנו.

הרכבה מהירה של מבנים מרובי גנים באמצעות שיבוט שער הזהב מודולרי

מאמר זה מציג פרוטוקול צעד-אחר-צעד המדגים כיצד ניתן להתאים שיבוט מודולרי (MoClo) לשיבוט של אופרון פוליציסטרוני.

הרכבה מודולרית סטנדרטית של אופרון פוליציסטרוני עם שיבוט מודולרי (MoClo) באמצעות ערכת הכלים In-Cloning

המחקר הנוכחי מתאר תהליך ריצוף ננו-נקבוביות של פלסמידים כאשר רצף הכרומוזומים כבר ידוע או אינו מעניין. שלב העשרת DNA בפלסמיד מבטיח עומק אופטימלי של רצף הפלסמידים וממקסם את מספר הדגימות שניתן לרצף בכל תא זרימה.

ריצוף והרכבה של פלסמידים לקריאה ארוכה באמצעות זרימות עבודה מבוססות ריצוף ננופורי

למדו שיטת הרכבה בתוך תאים (IVA) לשיבוץ DNA ביעילות גבוהה עד 99% באמצעות אנזימי תיקון DNA טבעיים בחיידקי E. coli. שיטה זו מייעלת מחקר בחלבונים חיידקיים ובהנדסה גנטית.

שימוש במכלול In Vivo לבניית פלסמיד ביעילות גבוהה

גלה סרטונים נוספים