Name: זיהוי FISH רגיש לפולימורפיזם נוקלאוטידי יחיד של שעתוק RNA ריבוזומלי ספציפי ללוקוס ב-Drosophila melanogaster (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 59 s
Description: למד את שיטת SNP-FISH לזיהוי שעתוק RNA ריבוזומלי ספציפי ללוקוס ב-Drosophila melanogaster. הפרוטוקול מאפשר הבחנה בין שעתוק מלוקוסי rDNA שונים וחקר מנגנוני הרגולציה התאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Baßler, J., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eurokaryotic+ribosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Eurokaryotic ribosome assembly.</a> Ann Rev Biochem. 88 (1), 1-26 (2018).</li>
<li>Hall, A. N., Morton, E., Queitsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+discovered%2C+long+out+of+sight%2C+finally+visible%3A+ribosomal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Genet%22%5BJournal%5D)">First discovered, long out of sight, finally visible: ribosomal DNA.</a> Trend Genet. 38 (6), 587-597 (2022).</li>
<li>Srivastava, R., Srivastava, R., Ahn, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epigenetic+pathways+to+ribosomal+DNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">The epigenetic pathways to ribosomal DNA silencing.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 545-563 (2016).</li>
<li>Kuo, B. A., Gonzalez, I. L., Gillespie, D. A., Sylvester, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ribosomal+RNA+variants+from+a+single+individual+and+their+expression+in+different+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Human ribosomal RNA variants from a single individual and their expression in different tissues.</a> Nucl Acid Res. 24 (23), 4817-4824 (1996).</li>
<li>Tseng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+ribosomal+RNA+genes+contain+multiple+differentially+regulated+variants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mouse ribosomal RNA genes contain multiple differentially regulated variants.</a> PLoS ONE. 3 (3), e1843(2008).</li>
<li>Locati, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+distinct+maternal+and+somatic+5.8S%2C+18S%2C+and+28S+rRNA+types+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Expression of distinct maternal and somatic 5.8S, 18S, and 28S rRNA types during zebrafish development.</a> RNA. 23 (8), 1188-1199 (2017).</li>
<li>Roussel, P., André, C., Comai, L., Hernandez-Verdun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rDNA+transcription+machinery+is+assembled+during+mitosis+in+active+NORs+and+absent+in+inactive+NORs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The rDNA transcription machinery is assembled during mitosis in active NORs and absent in inactive NORs.</a> J Cell Biol. 133 (2), 235-246 (1996).</li>
<li>Pontes, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+establishment+of+megabase-scale+gene+silencing+in+nucleolar+dominance%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Postembryonic establishment of megabase-scale gene silencing in nucleolar dominance.</a> PLoS ONE. 2 (11), e1157(2007).</li>
<li>Earley, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+HDA6-mediated+rRNA+gene+silencing%3A+suppression+of+intergenic+Pol+II+transcription+and+differential+effects+on+maintenance+versus+siRNA-directed+cytosine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of HDA6-mediated rRNA gene silencing: suppression of intergenic Pol II transcription and differential effects on maintenance versus siRNA-directed cytosine methylation.</a> Gene Dev. 24 (11), 1119-1132 (2010).</li>
<li>Greil, F., Ahmad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleolar+dominance+of+the+Y+chromosome+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nucleolar dominance of the Y chromosome in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 191 (4), 1119-1128 (2012).</li>
<li>Preuss, S., Pikaard, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rRNA+gene+silencing+and+nucleolar+dominance%3A+Insights+into+a+chromosome-scale+epigenetic+on%2Foff+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">rRNA gene silencing and nucleolar dominance: Insights into a chromosome-scale epigenetic on/off switch.</a> Biochim Biophys Acta. 1769 (5-6), 383-392 (2007).</li>
<li>Sharifi, S., Bierhoff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+RNA+pPolymerase+I+transcription+in+development%2C+disease%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of RNA pPolymerase I transcription in development, disease, and aging.</a> Ann Rev Biochem. 87 (1), 1-23 (2018).</li>
<li>Lu, K. L., Nelson, J. O., Watase, G. J., Warsinger-Pepe, N., Yamashita, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenerational+dynamics+of+rDNA+copy+number+in+Drosophila+male+germline+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Transgenerational dynamics of rDNA copy number in Drosophila male germline stem cells.</a> eLife. 7, e32421(2018).</li>
<li>Nurk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+sequence+of+a+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The complete sequence of a human genome.</a> Science. 376 (6588), 44-53 (2022).</li>
<li>Ritossa, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unstable+redundancy+of+genes+for+ribosomal+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Unstable redundancy of genes for ribosomal RNA.</a> Proc Natl Acad Sci. 60 (2), 509-516 (1968).</li>
<li>Nelson, J. O., Slicko, A., Yamashita, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retrotransposon+R2+maintains+Drosophila+ribosomal+DNA+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The retrotransposon R2 maintains Drosophila ribosomal DNA repeats.</a> Proc Natl Acad Sci. 120 (23), e2221613120(2023).</li>
<li>Warsinger-Pepe, N., Li, D., Yamashita, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nucleolar+dominance+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of nucleolar dominance in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 214 (4), (2020).</li>
<li>Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+SNVs+to+quantify+allele-specific+expression+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells.</a> Nat Meth. 10 (9), 865-867 (2013).</li>
<li>Davis, M. W., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ApE%2C+a+plasmid+editor%3A+A+freely+available+DNA+manipulation+and+visualization+program%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioinfo%22%5BJournal%5D)">ApE, a plasmid editor: A freely available DNA manipulation and visualization program.</a> Front Bioinfo. 2, 818619(2022).</li>
<li>Qazi, M. C. B., Heifetz, Y., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developments+between+gametogenesis+and+fertilization%3A+ovulation+and+female+sperm+storage+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The developments between gametogenesis and fertilization: ovulation and female sperm storage in Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 256 (2), 195-211 (2003).</li>
<li>Rogers, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+features+of+the+large+subunit+rRNA+expressed+in+Plasmodium+falciparum+sporozoites+that+distinguish+it+from+the+asexually+expressed+subunit+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Structural features of the large subunit rRNA expressed in Plasmodium falciparum sporozoites that distinguish it from the asexually expressed subunit rRNA.</a> RNA. 2 (2), 134-145 (1996).</li>
<li>Potapova, T., et al. Epigenetic control and inheritance of rDNA arrays. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPotapova%2C+T+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Tang, Y. Z., Gin, K. Y. H., Lim, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-temperature+fluorescent+in+situ+hybridization+for+detecting+Escherichia+coli+in+seawater+samples%2C+using+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">High-temperature fluorescent in situ hybridization for detecting Escherichia coli in seawater samples, using rRNA-targeted oligonucleotide probes and flow cytometry.</a> Appl Environ Microbiol. 71 (12), 8157-8164 (2005).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>PTC Tempo 96 Thermal Cycler</td><td>Bio Rad</td><td>12015382</td><td>ניתן להשתמש בכל מחזורי תרמי</td></tr><tr><td>0.2 מ"ל 8 רצועות צינורות PCR שטוחים</td><td>VWR</td><td>89133-912</td><td>ניתן להשתמש בכל צינורות תואמים</td></tr><tr><td>1 kb סולם DNA</td><td>NEB</td><td>N3232S</td><td>לשימוש בעת בדיקת רצף PCR גודל אמפליקון על ידי אלקטרופורזה ג'ל</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה מדורגים</td><td>ארה"ב מדעי</td><td>1615-5510</td><td>כל שפופרת ללא RNase מוסמכת תעשה</td></tr><tr><td>2 מ"מ dNTP Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0241</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE Buffer</td><td>Bio Rad</td><td>1610743</td><td>משמש לאלקטרופורזה של ג'ל. ניתן להשתמש בכל מאגר TAE.</td></tr><tr><td>5M NaCl</td><td></td><td></td><td>ניתן להשתמש או להכין כל NaCl מכל מקור</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>97064-250</td><td>ניתן להשתמש בכל Agarose</td></tr><tr><td>ApE - תוכנת עורך פלסמיד</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr> <tr><td>https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ לק</td><td></td><td></td> שקוף <td>ניתן להשתמש בכל לק מכל קמעונאי ניתן להשתמש</td></tr><tr><td>בזכוכית כיסוי, עובי מס' 1</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>6672A38</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד פישר דה-יונים</td><td>מדעי</td><td>NC9569627</td><td></td></tr><tr><td>דקסטרן סולפט נתרן</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D8906-10G</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td><td>Fine Science</td><td>Tools 11252-20</td><td>משמש לניתוח דגימות</td></tr><tr><td>EDTA (0.5M), Ph 8.0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R1021</td><td>ניתן להשתמש בכל מוצר דומה</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>VWR</td><td>89125-172</td><td>ניתן להשתמש בכל אתנול 200 הוכחה. משמש לדילול ל-70% אתנול לחדירה וניקוי לתנאים נטולי רנאז</td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>מערכת אלקטרופורזה מיני ג'ל אופקית</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-170</td><td>ניתן להשתמש בכל מערכת אלקטרופורזה של ג'ל</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-בדיקה מכתים צלחת</td><td>אלקטרון מדעי המיקרוסקופיה</td><td>71564</td><td>משמש לניתוח דגימות</td></tr><tr><td>שייקר תזונתי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>BMSB3D1020</td><td>ניתן להשתמש בכל שייקר תזונתי</td></tr><tr><td></td><td>Parafilm USA Scientific</td><td>3023-4526</td><td></td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט (10X) pH 7.4, RNase ללא</td><td>Life Technologies</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>פירס 16% פורמלדהיד (w/v), טכנולוגיות חיים ללא מתנול</td><td></td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>דיוק טכנולוגיות חיים לאמבט מים לשימוש כללי</td><td></td><td>TSGP02</td><td>ניתן להשתמש בכל אמבט מים</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>ניתן להשתמש בכל ערכת מיצוי ג'ל</td></tr><tr><td>Recombinant Proteinase K Solution (20 מ"ג/מ"ל)</td> <td>Invitrogen</td><td>AM2546</td><td>ניתן להשתמש בכל מוצר דומה ללא</td></tr><tr><td>Rnase UltraPure BSA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM2618</td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae tRNA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8759</td><td></td></tr><tr><td>SSC (20X), ללא RNase</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9763</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Life Technologies</td><td>A16046.AE</td><td></td></tr><tr><td>UltaPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15567027</td> ניתן <td>להשתמש</td></tr> <tr><td>בכל מוצר דומהטכנולוגיות חיים במים מזוקקים ללא DNase/RNase UltraPure</td><td></td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>קומפלקס ריבונוקלאוזיד ונדיל</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD מדיית הרכבה עם DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td></td></tr><tr><td>שקופית מיקרוסקופ סופרפרוסט VWR</td><td></td><td>48311-601</td><td></td></tr><tr><td>y[1]w[1] קו Drosophila melanogaster</td><td>מרכז מניות בלומינגטון דרוזופילה</td><td>1495</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 980 מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>מיקרוסקופ</td><td></td> צייס <td>ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ קונפוקלי עם פליטה וזיהוי תואמים ניתן להשתמש</td></tr><tr><td>במיקרוסקופ סטריאו Zeiss Stemi 2000-C ומקור אור</td><td>מיקרוסקופ מרכזי</td><td>455053</td> ניתן <td>להשתמש בכל מיקרוסקופ סטרומיקרוסקופ</td></tr></tbody></table>

זיהוי fish רגיש לפולימורפיזם נוקלאוטידי יחיד של שעתוק rna ריבוזומלי ספציפי ללוקוס ב-drosophila melanogaster

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH Detection of Locus-specific Ribosomal RNA Transcription in Drosophila melanogaster

תוצאות ריצוף מגנוטיפ SNP צפויות לזהות הבדלים ב-SNP בין מיקומי ה-X וה-Y rDNA. SNPs אלה מזוהים על ידי הערכה ישירה של מיקומי ה-SNP ברצף כרומטוגרמות (איור 2). לריצוף של דגימות נקבות צפוי להיות אות ריצוף יחיד במיקום SNP, מה שמצביע על הומוזיגוטיות SNP בין שני כרומוזומי X (איור 2A). תוצאות ריצוף מדגם גברים צפויות להיות בעלות שיא כפול במיקום SNP (איור 2B). בהתבסס על הגנוטיפ של כרומוזום X שנקבע מריצוף דגימה נשית, ניתן להסיק כי הווריאנט שאינו X הוא SNP rDNA של כרומוזום Y (כלומר, X = T, Y = C עבור ריצוף 18S SNP באיור 2). לחלופין, שיא ריצוף יחיד במיקום SNP בדגימה הזכרית יצביע על הומוזיגוטיות בין מיקומי rDNA זכריים ונקביים במיקום SNP זה, ומיקום זה לא יהיה שמיש עבור rRNA SNP-FISH.
בעקבות הפרוטוקול עבור SNP FISH, ניתן לדמיין דגימות על ידי הרכבה על שקופיות ולהניח אותן מתחת להחלקת כיסוי אטומה, ואחריה מיקרוסקופיה קונפוקלית. באמצעות הבדיקות המפורטות בטבלה 3, אות ה-rRNA הנגזר מ-Y מזוהה על ידי פליטת Alexa Fluor 647 ואות ה-rRNA הנגזר מ-X מזוהה על ידי פליטת Alexa Fluor 488. אותות rRNA צפויים להיצפה בגרעין, שניתן לזהות כחור דל DAPI בגרעין (איור 3A). קל במיוחד לזהות את הגרעין בתאי נבט בשל הגרעין והגרעין הגדולים שלהם (איור 3A). האות החלש יכול להימצא בדרך כלל גם בציטופלזמה (איור 3), אך זהו אות לא ספציפי שניתן לזהות גם בדגימות ללא rRNA המכיל SNP משלים (כלומר, אות Y בתאים חסרי Y rDNA או אות X בתאים חסרי X rDNA; איור 3B-C). יתר על כן, לפעמים ניתן לזהות תיוג משותף מלאכותי של X ו-Y rRNA במרכז הסומטי, אפילו בדגימות שחסרות מיקומי X או Y rDNA (איור 3B-C, חיצים צהובים). לפיכך, יש להשתמש רק באותות גרעיניים כדי להעריך שעתוק ספציפי למיקום. לרוב התאים, במיוחד תאים סומטיים, צפוי להיות רק אות Y rRNA, מה שמצביע על כך ש-rRNA מועתק באופן בלעדי ממיקום ה-Y rDNA (איור 3A, עיגול מקווקו צהוב וחץ אדום)10,17. עם זאת, ביטוי משותף של X ו-Y rRNA מזוהה לעתים קרובות בתאי נבט, במיוחד תאי גזע של קו הנבט13 (איור 3A, עיגולים מנוקדים לבנים). אותות rRNA X ו-Y בתאים המבטאים במשותף יכולים להיות סמוכים וליצור גרעין יחיד (איור 3A, תא עליון), או יכולים להיות נפרדים, וליצור שני גרעינים (איור 3A, תא תחתון). הדוגמאות באיור 3 מסופקות מ-rDNA SNP-FISH באמצעות ערכות בדיקה המכוונות לשני SNPs בלבד (שני ה-SNPs של ITS1), מה שמדגים שרק שני SNPs נחוצים עבור rDNA SNP-FISH. עם זאת, אותות חזקים יותר נצפים בעת שימוש בבדיקות המכוונות לכל ארבעת ה-SNPs13.
בקרות שליליות הן הכללה חשובה לבדיקה זו כדי לאשר שבדיקות אינן מגיבות עם יעד SNP שגוי, במיוחד כאשר פותרים לראשונה את השיטה. בקרות שליליות של כרומוזום X כוללות כל מצב שחסר כרומוזום X rDNA, כגון זכרים המכילים כרומוזום X עם מחיקת rDNA. הבקרות השליליות של כרומוזום X צפויות לזהות רק אות Y rRNA ולא X rRNA (איור 3B). בקרות שליליות של כרומוזום Y כוללות כל מצב שחסר כרומוזום Y rDNA. כמה דוגמאות למצבים אלה הם רקמות נקביות XX, רקמות מזכרים חסרי כרומוזום Y, או זכרים המכילים כרומוזום Y עם מחיקת rDNA15. הבקרות השליליות של כרומוזום Y צפויות לזהות רק אות X rRNA ואין להן אות Y rRNA הניתן לזיהוי (איור 3C). שים לב שפקדים אלה חשובים לא רק לקביעת ספציפיות הבדיקה, אלא גם לקביעת כל רקע או חפצים של האות. ניתן להשתמש במדויק בכל בדיקות או תנאי בדיקה חדשים המספקים ספציפיות בבקרות כאלה כדי לזהות שעתוק rDNA ספציפי למיקום.
תנאים גנטיים, התפתחותיים או סביבתיים שונים עשויים לשנות את הסבירות ש-rDNA מועתק באופן בלעדי ממיקום ה-rDNA של כרומוזום Y13,17. ניתן לכמת את תדירות שעתוק ה-rDNA מלוקוס בודד או ממספר מיקומים ולהשוות ישירות בין דגימות. על מנת להשוות כמותית הבדלים בשעתוק לוקוס rDNA, כל תא חייב להיות מסווג בנפרד כדומיננטי Y, דומיננטי משותף או דומיננטי X. תאים מסווגים כדומיננטיים ב-Y ו-X רק אם רק האות המתאים מזוהה. כל תא עם אותות Y ו-X rRNA נחשב לדומיננטי, גם אם אות אחד חלש בהרבה מהשני. לפיכך, תאים המכילים אותות X ו-Y חזקים מאוד נחשבים מבחינה איכותית זהים לתאים עם Y חזק ו-X חלש או אותות X חזקים ו-Y חלשים. ניתן להשוות את האחוז הכולל של כל התאים בכל הדגימות בכל קטגוריה בין דגימות על ידי מבחן חי בריבוע. בעוד שבדיקה זו פועלת היטב כדי לקבוע באופן איכותי אם לוקוס rDNA מסוים מתומלל או לא, לא ראינו הערכות עקביות בין דגימות בעת כימות ישיר של עוצמת הקרינה של אותות SNP-FISH בודדים. לפיכך, איננו ממליצים לבצע הערכות כמותיות של עוצמת אות FISH בין דגימות או את העוצמה היחסית של אותות rDNA X ו-Y בתוך תא בודד. המקור לחוסר עקביות זה בעוצמת הקרינה אינו ברור, אם כי ייתכן שהוא נובע מקשירה לא יעילה של בדיקות מוסוות שאינן נקשרות לכל ה-rRNA המטרה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig01.jpg"> 
איור 1: דיאגרמה של שיטת SNP-FISH. (A) בדיקות אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס מסורתיות של FISH מגיבות עם RNA שאינו מטרה הנבדלים זה מזה בנוקלאוטיד אחד בלבד. (B) שיטת SNP-FISH משתמשת באוליגו-נוקלאוטיד מסכה משלימה הקשור לאזור 3' של בדיקת האוליגו-נוקלאוטיד. המסכה משאירה רק 10 נוקלאוטידים חופשיים להיקשר לרצף המטרה. אזור בדיקה ללא מסיכה אינו נקשר ביציבות לרצפים שאינם מטרה הנבדלים בנוקלאוטיד אחד או יותר. המסכה מתנתקת מהגשושית לאחר שהגשושית נקשרת למטרה, ומאפשרת קשירה יציבה בין הגשושית למטרה. (C) בדיקות SNP מזווגות עם תוויות שונות בשילוב עם מסכה משותפת קושרות באופן ספציפי מטרות הנבדלות בנוקלאוטיד בודד ללא תגובה צולבת. (D) ניתן לאגד בדיקות מרובות יחד כדי לסמן באופן ספציפי הפלוטיפים מובחנים של rRNA. ארבעה הבדלים ב-SNP אופיינו בין מיקומי X ו-Y rDNA בזן y1w1 Drosophila melanogaster . SNP אחד ב-18S rRNA, אחד ב-28S rRNA, ושניים בחלק ה-ITS1 של ה-pre-rRNA. מוצגים הפלוטיפים rRNA ספציפיים ל-X ו-Y המשמשים עבור SNP-FISH. בדיקות המכוונות לגרסאות X rDNA בארבעת ה-SNPs של rRNA מצומדות לפלואורופור נפוץ (ירוק), ובדיקות המכוונות לגרסאות Y rDNA מצומדות לפלואורופור אחר (מג'נטה). מסכה משותפת משמשת לכל SNP (ארבעה בסך הכל). קשירת בדיקה ספציפית ל-SNP בכל מיקום SNP ב-rRNA יכולה לתייג באופן ספציפי rRNA ממיקומי ה-rDNA X ו-Y עם עד ארבע בדיקות אוליגונוקלאוטידים של FISH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig02.jpg"> 
איור 2: דוגמאות לתוצאות ריצוף rDNA SNP הומוזיגוטיות והטרוזיגוטיות. דוגמה לרצף כרומטוגרמות מריצוף 18S SNP של DNA מדגימות (A) נקבה ו-(B) זכר. מיקום SNP 18S מסומן בכוכבית (*). אות התימין היחיד (T) עבור מיקום ה-SNP בדגימה הנשית מצביע על תימין במיקום SNP במיקום ה-rDNA של כרומוזום X. האות הכפול במיקום SNP המפוצל בין תימין לציטוזין (C) בדגימה הגברית מצביע על ציטוזין במיקום SNP בלוקוס rDNA של כרומוזום Y (מוסק על ידי ידיעה שתימין נמצא במיקום כרומוזום X). תוצאות הריצוף נצפו באמצעות ApE - תוכנת עורך פלסמיד19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig03.jpg"> 
איור 3: דוגמאות לתוצאות SNP-FISH באשך Drosophila באמצעות שתי ערכות בדיקה SNP-FISH בלבד. דוגמאות SNP FISH באשך של בעלי חיים עם (A) גם X וגם Y rDNA, (B) רק Y rDNA, או (C) רק X rDNA. דוגמאות אלה השתמשו רק בערכות בדיקה המתייגות את שני ה-SNPs של ITS1 rRNA, מה שמדגים כי דגי rRNA SNP עובדים עם שני SNPs מטרה בלבד. תאי נבט מזוהים על ידי הגרעין העגול הגדול שלהם, ותאים סומטיים על ידי הגרעין הקטן והפחות עגול שלהם. תאי גזע של קו הנבט מזוהים על ידי מיקומם ישירות ליד הרכזת הסומטית, המסומנת בכוכבית (*). תאי נבט המתעתקים rDNA הן מאתרי ה-X והן מ-Y rDNA מזוהים על ידי אותות FISH גרעיניים X ו-Y (עיגולים מנוקדים לבנים, A-A'). לתאי נבט המתעתקים DNA רק ממיקום Y rDNA יש רק אות FISH גרעיני Y (עיגול מקווקו צהוב). תאים סומטיים המבטאים Y בלבד מסומנים בחץ אדום. ניתן לצפות בתיוג משותף מלאכותי של מיקומי X ו-Y rDNA במרכז הסומטי (חץ צהוב). סרגל קנה המידה הוא 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
קובץ משלים 1: רצף rRNA של מיקום כרומוזום X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/Dm_45S_rRNA.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>

זיהוי FISH רגיש לפולימורפיזם נוקלאוטידי יחיד של שעתוק RNA ריבוזומלי ספציפי ללוקוס ב-Drosophila melanogaster

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences ...

single-nucleotide-polymorphism-sensitive-fish-detection-locus

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

כאן אנו מתארים שלם הר...

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

אנו מתארים פרוטוקול חזק ותכליתי לניתוח ארכיטקטורה גרעינית ידי דגי DNA 3D באמצעות בדיקות ניאון שכותרתו ישירות.

דגי ה-DNA 3D חזקים באמצעות בדיקות שכותרתו ישירות

PCR בשילוב עם ניתוח ברזולוציה גבוהה להמיס (HRMA) הוא הוכיח כשיטת מהירה ויעילה לגנוטיפ דג הזברה.

מהירה ויעילה דג הזברה Genotyping באמצעות PCR עם רזולוציה גבוהה ממיסים ניתוח

מטרתו של פרסום זה היא לדמיין ולדון בצעדים האופרטיביים של פרוטוקול צפון כתם משופר על RNA שחולץ מתסיסנית עוברים, תאים ורקמות. פרוטוקול זה שימושי במיוחד לאיתור יעיל של מיני RNA קטנים.

Enhanced צפון כתם איתור של RNA קטן מינים ב תסיסנית

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) מסוגל ללכוד תרגום ספציפי לסוג התא של mRNA. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול TRAP הראשון המוקדש לבידוד mRNA באוכלוסיות תאים נדירות של עוברי דרוזופילה.

מלכודת RC, תרגום ריבוזום זיקה טיהור מאוכלוסיות תאים נדירות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

המתואר RNA בחיי עיר הכלאה פרוטוקול מאפשרת הגילוי של RNA כל עוברי דרוזופילה או רקמות גזור. באמצעות לוחות 96-ובכן microtiter tyramide אות הגברה, תעתיקים שניתן לאתר ברזולוציה גבוהה, רגישות, ואת התפוקה, בעלות נמוכה יחסית.

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור ויזואליזציה, זיהוי, ניתוח ומעקב של סחר האנטי-מסוגגני mRNA בחיים Drosophila ילה מלאנוסטר תא ביצה באמצעות משואות מולקולריות, מיקרוסקופיה דיסק מסתובב, וניתוח קוד פתוח תוכנה.

חזותי ומעקב אחר mRNAs בשידור חי דרוזוסופילה מלאנוגסטר צ'יימברס

פלואורסצנטיות RNA מולקולה אחת בהכלאה במקום (smFISH) היא שיטה לכימות מדויק של רמות ולוקליזציה של RNAs ספציפיים ברמת התא הבודד. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקולי המעבדה המאומתים שלנו לעיבוד ספסל רטוב, הדמיה וניתוח תמונה לכימות תאים בודדים של RNAs ספציפיים.

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

כאן, אנו מציגים פרוטוקול תיוג גנים אנדוגני פשוט עבור דרוזופילה, המשתמש בטכניקה מבוססת PCR לזיהוי ללא סמנים של שינויים גנטיים מוצלחים, מה שמקל על פיתוח קווי דפיקה יציבים.

אסטרטגיה מבוססת CRISPR בצעד אחד לתיוג גנים אנדוגניים בדרוזופילה מלנוגסטר

דרוזופילה היא מודל מבוסס היטב לחקר מולקולות מפתח המווסתות מיוגנזה. עם זאת, השיטות הנוכחיות אינן מספיקות כדי לקבוע דינמיקת שעתוק mRNA והתפלגות מרחבית בתוך סינציטיה. כדי להתמודד עם מגבלה זו, ביצענו אופטימיזציה של שיטת הכלאה פלואורסצנטית באתרה של RNA המאפשרת זיהוי וכימות של mRNA בקנה מידה של מולקולה אחת.

חקר דינמיקת שעתוק שרירים בסקאלות של מולקולות בודדות בדרוזופילה

Expand-Assisted Fluorative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) היא טכניקה חזקה המשלבת מיקרוסקופ הרחבה עם הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) כדי לזהות ביטוי של גנים מרובים ברקמה עבה. פרוטוקול זה מתאר את ההתקדמות האחרונה בשיטה ואת התאמתה לתיוג מערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה השלמה.

זיהוי מולטיפלקס של ביטוי גנים במוח הדרוזופילה השלם באמצעות פלואורסצנציה איטרטיבית בסיוע הרחבה בהכלאה באתרה

למד את שיטת SNP-FISH לזיהוי שעתוק RNA ריבוזומלי ספציפי ללוקוס ב-Drosophila melanogaster. הפרוטוקול מאפשר הבחנה בין שעתוק מלוקוסי rDNA שונים וחקר מנגנוני הרגולציה התאית.

זיהוי FISH רגיש לפולימורפיזם נוקלאוטידי יחיד של שעתוק RNA ריבוזומלי ספציפי ללוקוס ב-Drosophila melanogaster

גלה סרטונים נוספים