זיהוי FISH רגיש לפולימורפיזם נוקלאוטידי יחיד של שעתוק RNA ריבוזומלי ספציפי ללוקוס ב-Drosophila melanogaster

המחקר שלנו מתמקד בהבנת האופן שבו תאים חשים, מנטרים ומווסתים את מיקומי ה-DNA הריבוזומליים המרובים בתוך הגנום שלהם. באופן ספציפי, אנו שואפים לחשוף את המנגנונים המבדילים אילו מיקומי rDNA מתועתקים באופן פעיל וכיצד מיקומים אלה מווסתים באופן אינדיבידואלי. לאחרונה גילינו שכמות ה-rDNA בתא יכולה להשתנות עם הזמן, ושהשינוי הזה משנה את מיקומי ה-rDNA המשועתקים.

כעת אנו מבינים שתאים ישנו את שעתוק ה-rDNA שלהם בהתבסס על כמות ה-rDNA שיש להם. תגלית זו מובילה אותנו לשאול כיצד תאים יודעים כמה RDA יש להם וכיצד הם קובעים איזה מיקום rDNA הם יעדיפו לבטא. המעבדה שלנו מתמקדת כעת בהבנת המנגנון שבו התאים משתמשים כדי להבחין בין מיקומי rDNA שונים ולחוש ולווסת את פעילותם.

תחת סטריאומיקרוסקופ, נתח את דרוזופילה כדי לבודד אשכים ב-PBS נטול RNase. כדי להתחיל, אחוז באמצע הבטן עם זוג מלקחיים אחד ובקצה הבטן עם זוג אחר כדי למשוך בעדינות את החיה זו מזו. בעזרת מלקחיים מעבירים את האשכים המבודדים מכלי החיתוך לצינור מיקרופוגה בנפח 1.5 מיליליטר המכיל 0.5 מיליליטר PBS נטול RNase.

שאפו את ה- PBS והוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת קיבוע. הניחו את הדגימה על שייקר אגוזים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, שאפו את תמיסת הקיבוע.

לאחר מכן שטפו את הדגימה פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS למשך חמש דקות כל אחת על שייקר אגוזים. לאחר שאיבת ה-PBS, הוסף מיליליטר אחד של אתנול 70% ללא RNase ודגר את הדגימה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה על שייקר אגוזים. לאחר מכן, שאפו את האתנול והוסיפו מיליליטר אחד של מאגר כביסה לדגימה.

דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר על שייקר אגוזים למשך שלוש דקות. לאחר מכן, הניחו לצינור לנוח זקוף למשך שתי דקות. מערבבים את הבדיקות והמסכות עם מאגר ההכלאה כדי להכין נפח כולל של 100 מיקרוליטר לדגימה כפי שמוצג כאן.

לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת הכלאה לדגימה לאחר שאיבת מאגר הכביסה. מרחו סרט שקוף כדי לאטום את שולי הצינור. עטפו את הצינור בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור ודגרו את הדגימה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות.

מבלי לשאוב את תמיסת ההכלאה, הוסף מיליליטר אחד של מאגר כביסה לדגימה. דגרו את הדגימה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך. לאחר שאיבת מאגר הכביסה, הוסף מיליליטר אחד של מאגר כביסה טרי לדגימה ודגר שוב.

בתום הדגירה, שאפו את מאגר הכביסה והוסיפו לדגימה 50 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה. תחת סטריאומיקרוסקופ מנתח, השתמש בפיפטה כדי להעביר את הדגימה לשקופית מיקרוסקופ. בעזרת מלקחיים, סדרו את האשכים בשורה על שקופית המיקרוסקופ כדי להקל על זיהוי הדגימה במהלך ההדמיה.

כסו את הדגימה בפתק כיסוי ומחקו את שולי החלקת הכיסוי במגבון טישו כדי להסיר עודפי מדיית הרכבה. אטמו את שולי החלקת הכיסוי עם לק והשאירו אותם בחושך בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי לאפשר ללק להתייבש. אותות rRNA זוהו בגרעין, והופיעו כאזורי נקבוביות DAPI בתוך הגרעין, במיוחד בתאי נבט עם גרעינים וגרעינים גדולים.

אותות קלושים ולא ספציפיים נצפו בציטופלזמה בדגימות חסרות מיקומי rRNA. ברוב התאים, אותות YrRNA זוהו באופן בלעדי, מה שמעיד על שעתוק rRNA ממיקום YrDNA. ביטוי משותף של X ו-YrRNA נצפה בתאי נבט, כאשר אותות מתמזגים לגרעין יחיד או נפרדים לשני גרעינים.