מתן חומרי הרדמה נדיפים לזחלי דג הזברה לתצפית התנהגותית

המחקר שלנו מתמקד בפרמקולוגיה של הרדמה, הכוללת עניין במנגנוני הרדמה כמו גם במנגנונים של תופעות לוואי של הרדמה. השימוש בדג זברה זחל כמודל התנהגותי לחקר פרמקולוגיה של הרדמה מתרחב במהירות ויש לו יתרונות רבים, כולל התאמתם לשימוש בניסויי סינון בקנה מידה גדול. השוואה בין חומרי הרדמה נדיפים ותוך ורידיים נותרה מאתגרת מכיוון שמתן חומרי הרדמה נדיפים לבעלי חיים שאינם מימיים הוא הרבה יותר קל מאשר הרדמה תוך ורידית.

לעומת זאת, חומרי הרדמה תוך ורידיים ניתנים בקלות רבה יותר לבעלי חיים ימיים מאשר חומרי הרדמה נדיפים. פרוטוקול זה מספק אמצעי זול ונגיש יחסית למתן חומרי הרדמה נדיפים בתא סגור לביצוע ניסויים התנהגותיים בזחלי דג זברה. פרוטוקולים אחרים מסוג זה דורשים לעתים קרובות צורה כלשהי של מכשירים מותאמים אישית שיכולים להיות יקרים או לא נגישים לאלה שאין להם את האמצעים ליצור או לרכוש ציוד מסוג זה.

כדי להתחיל, הניחו יריעת סיליקון בגודל 0.5 מילימטר על משטח נקי ושטוח. בדוק את הסדינים לאיתור קמטים והימנע מהם במידת האפשר. נקו את הסדינים עם 70% אלכוהול כדי להסיר שמן או פסולת.

כאשר הסדין יבש לחלוטין, השתמש במוליך כגון מברשת, כדי למרוח שכבה דקה ואחידה של פריימר דבק על יריעת הסיליקון. לאחר מריחת הפריימר הדביק, יישר את הסרט המצופה כפול עם יריעת הסיליקון כשגב הנייר פונה כלפי מעלה. מרחו את הסרט בהדרגה על הסיליקון בעזרת גלגלת כדי להחליק את פני השטח ולהסיר בועות אוויר.

יש למרוח מחדש את הפריימר בחלקים קטנים לפי הצורך, ולהמשיך במריחת הסרט כשהפריימר מתייבש תוך שנייה עד חמש שניות. הפוך את יריעת הסיליקון כדי לעבוד עם צד הסיליקון כלפי מעלה כדי לסייע בהדמיה והסרה של בועות אוויר. לאחר מכן, חותכים את הסיליקון הדביק לרצועות ברוחב של 10 מילימטרים לפחות.

ודא שהרצועות ארוכות מספיק כדי לכסות לפחות את רוחב שורה אחת של צלחת הבאר. כדי להכין את חומרי ההרדמה הנדיפים, הוסף נפח של הממס הלא נדיף לבקבוקון HPLC או נצנוץ, והבטיח מרווח ראש מינימלי לאחר הוספת הדילול הסופי של חומר ההרדמה הנדיף. השתמש במזרק אטום לגז של המילטון כדי להוסיף את חומר ההרדמה הנדיף ולאטום במהירות את הבקבוקון.

מערבבים את הבקבוקונים על ידי מערבולת או סוניקציה לפי הצורך. אחסן אותם באופן זמני בזמן הכנת צלחות דג הזברה. כדי להגדיר את הניסוי ההתנהגותי, העבירו דג זברה זחל אחד חמישה ימים לאחר ההפריה לכל שורה שנייה של צלחת זכוכית 96 בארות.

הסר בזהירות את תמיסת ה- E-three מכל באר. השתמש בפיפטת העברה כדי למלא כל באר בשורה בתמיסה הניסיונית. בעזרת רצועות הסיליקון הדביקות, לחץ את הרצועה כלפי מטה במהירות כדי למנוע היווצרות בועות ודגים לעלות על גדותיהם לבארות סמוכות.

לאחר מכן לחץ בחוזקה על החלק העליון של הצלחת כדי להבטיח שכל באר אטומה. חזור על תהליך האיטום עד להחלפת התמיסה וכל הבארות בכל שורה שנייה של הצלחת אטומות. הפוך בעדינות את הצלחת ובדוק אם יש בועות אוויר.

הנח את הצלחת ביחידת תצפית ההתנהגות כשצד דבק הסיליקון כלפי מטה, ובצע את הניסוי ההתנהגותי. בבארות האטומות, ריכוז הסבופלורן הראה אובדן מינימלי במשך שלוש שעות, ואיזופלורן הראה ירידה של 4% בריכוז. אף אחד מחומרי ההרדמה לא הראה אובדן משמעותי במהלך 30 עד 60 הדקות הראשונות.

הריכוז האפקטיבי החציוני לסבופלורן היה 62 מיקרומולר לתנועה ספונטנית ו-126 מיקרומולר לתנועה מעוררת כאשר הסולם נמוך משמעותית מ-240 מיקרומולר שדווח בעבר, מה שעשוי לנבוע משיפור ביצירת אטימה אטומה לגז בשיטה זו. הבדל משמעותי בתנועה הספונטנית נצפה בין בארות פתוחות ואטומות, שהתגלה לאחר שעתיים, ככל הנראה עקב דלדול החמצן בבאר, ומהווה מגבלה חשובה של טכניקה זו.