חקר מוות תאי מתוכנת המושרה על ידי ננו-חלקיקי נחושת בחיידקים

מחקר זה חוקר את היעילות של קוטל חיידקים ננו-חלקי נחושת נגד שלושה חיידקים נפוצים בעלי משמעות קלינית. הוא בוחן מקרים הכוללים יצירת ROS ומעורבות פוטנציאלית של מוות תאי מתוכנת.

אחד האתגרים הנוכחיים הוא השגת ספירת מושבות עקבית. אני מאמין שזה נובע מהתערבות. מודרניזציה של תאים במהלך דילול נובעת ספירה מזויפת עם מיקום בהשוואה לספירה מנוסה יותר.

הקבוצה שלנו הייתה הראשונה שהשתמשה במודולטור תאים כדי לחקור מנגנונים קוטלי חיידקים של ננו-חלקיקי נחושת, וחשפה שמוות חיידקי כרוך בתהליכים תאיים כמו יצירת ROS ואוטופגיה.

הפרוטוקול עונה על הצורך בהבנה מעמיקה יותר של המנגנון שבאמצעותו ננו-חלקיקי נחושת הורגים חיידקים, במיוחד תוך התמקדות באזור שאינו נחקר מספיק של מסלולי מוות תאי מתוכנתים של חיידקים.

באמצעות מודולטורים שונים של תאים, אישרנו שמוות חיידקי הנגרם על ידי ננו-חלקיקי נחושת כרוך באוטופגיה ועומס יתר של ROS וזיהינו מסלולים מרכזיים הנתמכים על ידי ניסויים אמינים מבוססי טריפליקטים עם ייעוד פשוט

[קריין] להתחיל להשיג ננו-אבקות נחושת מסחריות בקוטר של 25 ננומטר ו-60 עד 80 ננומטר מספק מסחרי. השתמש במיליליטר אחד של SDS מילי-מולרי אחד כחומר פיזור עבור כל גודל ננו-חלקיקים. לאחר מכן פזרו את הננו-חלקיקים באמצעות אמבט קולי למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השג את הזנים Escherichia coli, Acinetobacter baumannii ו-Staphylococcus aureus ממרכזי המשאבים הביולוגיים המתאימים. תרבית כל חיידק ב -10 מיליליטר מרק LB בתנאים אירוביים ב -37 מעלות צלזיוס. לדלל תרביות חיידקים במדיום LB כדי להגיע לצפיפות אופטית של כ-0.5 ב-600 ננומטר. כעת השתמש בתמיסות ננו-חלקיקי נחושת כדי להכין טווח ריכוזים בין אפס ל-100 מיקרוגרם למיליליטר בשני הגדלים. פיפטה 500 מיקרוליטר מתרביות החיידקים לצינורות מיקרוצנטריפוגה וצנטריפוגה ב -3,300 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הוצאת הסופרנטנט, הוסיפו ריכוזים שונים של שני הגדלים של הננו-חלקיקים לכל צינור. התייחס לקבוצות ביקורת עם 500 מיקרוליטר PBS כבקרה שלילית ו-500 מיקרוליטר של 70% אלכוהול כבקרה חיובית. לאחר מכן דגרו את כל הדגימות בניעור במהירות של 200 סיבובים לדקה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר הדגירה יש לשטוף את החיידקים עם PBS ולפזר אותם על צלחות אגר LB. דגרו את הצלחות בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. למחרת, ספרו מושבות על כל צלחת עבור כל קבוצות הטיפול. טפל בחיידקים עם חמישה מיקרו-מולרי SBI למשך שעתיים, 0.5 מיקרו-מולרי נקרוסולפונמיד למשך שעה, 100 ננו-מולרי וורטמנין למשך 30 דקות, או 100 ננו-מולרי Z-VAD למשך 30 דקות. לאחר השלמת כל הטיפול המקדים, צנטריפוגה את כל הצינורות ב-3,300 גרם למשך 10 דקות. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה ב-800 מיקרוליטר PBS כדי לשטוף את מאפנן הטיפול המקדים. מחלקים את הכדורים התלויים. צנטריפוגה כל צינור, ואז השליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את הכדורים בתערובות אפנון ננו-חלקיקים לפני הדגירה בתסיסה. כעת הוסף 70% אתנול ו-PBS כבקרות חיוביות ושליליות. כלול קבוצות ביקורת ריקות שטופלו במעכבים, אך לא ננו-חלקיקים. לאחר הדגירה, פיפטה את מגיב כדאיות התא ביחס נפח אחד לעשרה ודגירה. לאחר צנטריפוגה נוספת של התרבויות, העבירו את הסופרנטנטים לצלחות של 96 בארות. מדוד פלואורסצנטיות בעירור של 560 ננומטר ופליטה של 590 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות. לדלל את הסופרנטנטים הנותרים ל-10 בחזקת שלילי 5 ו-10 בחזקת שלילי 4 ולפזר על לוחות אגר LB לתרבית. ספרו את המושבות הבודדות למחרת. תרביות חיידקי פיפטה לצינורות מיקרו-צנטריפוגה. לאחר מכן חשוף את התרביות לאור אולטרה סגול של 405 ננומטר למשך שלוש שעות. לאחר מכן, דגרו על התרבויות בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר מכן דגרו על החיידקים בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר טיפול בקור, דגרו את החיידקים במי חמצן 3% למשך 30 דקות. שמור על קבוצת ביקורת ב-37 מעלות צלזיוס במרק LB. כעת טפלו בחיידקים עם חלקיקים של 20 או 60 ננומטר בריכוזים שבין 1 ל-100 מיקרוגרם למיליליטר למשך 24 שעות. לאחר מכן שטפו את החיידקים המטופלים פעמיים עם PBS. לאחר הצנטריפוגה, השעו מחדש את כדורי החיידקים בתמיסה של חמישה מיקרו-מולרים של צבע דיכלורודיהידרופלואורסצאין דיאצטט 2',7'. נתח את עוצמת הקרינה בפליטה של 520 או 530 ננומטר. ספירת המושבות של Escherichia coli הופחתה משמעותית על ידי 20 ננומטר ננומטר ננומטר ננומטר ננומטר במיקרוגרם אחד למיליליטר וב-60 ננומטר ננומטר בחמישה מיקרוגרם למיליליטר. סטפילוקוקוס זהוב הראה ירידה משמעותית בספירת המושבות בכל הריכוזים של שני גדלי הננו-חלקיקים. ב-Acinetobacter baumannii, הפחתה במספר המושבות דרשה חמישה מיקרוגרם למיליליטר של ננו-חלקיקי נחושת של 20 ננומטר ו-10 מיקרוגרם למיליליטר של ננו-חלקיקי נחושת של 60 ננומטר. טיפולים בננו-חלקיקי נחושת גרמו לייצור מיני חמצן ריאקטיביים בכל החיידקים, כאשר חלקיקים של 20 ננומטר מראים את השברים הגבוהים ביותר של תאים חיוביים בריכוזים נמוכים יותר. לעומת זאת, טיפולי ננו-חלקיקי נחושת של 60 ננומטר הובילו ליצירת מיני חמצן תגובתיים עקביים בכל הריכוזים. מודולטור מוות תאי מתוכנת Z-VAD הגדיל את ההישרדות של Escherichia coli שטופל בשני גדלי הננו-חלקיקים בריכוזים נמוכים עד בינוניים. הטיפול ב-NSA שיפר את ההישרדות של Staphylococcus aureus בכל ריכוזי ננו-חלקיקי הנחושת של 20 ננומטר. Acinetobacter baumannii הראה כדאיות משופרת עם Z-VAD תחת 1, 5 ו-10 מיקרוגרם למיליליטר של חשיפה לחלקיקי נחושת של 20 ו-60 ננומטר, בעוד שה-NSA הגדילה את הכדאיות ב-10 מיקרוגרם בלבד למיליליטר של חשיפה לננו-חלקיקי נחושת של 20 ננומטר.