דלדול מהיר של מקרופאגים כלייתיים באמצעות כלי אבלציה של תאים CD59/Intermedilysin אנושי

אנו משתמשים בהתערבות בתיווך אינטרמדיליזין של התא המבטא CD59 האנושי בעכברים כדי לחקור התחדשות מיקרופאגים כלייתיים, תוך התמקדות בהחזרת מונוציטים מונעת כימוקין ובהקמת נישה של מעקב חיסוני לאחר פגיעה. התפתחויות אחרונות בתחום שלנו חושפות מנגנון של התחדשות מקרופאגים כלייתיים, תוך הדגשת כימוקין ספציפי המגייס מקרופאגים וכיצד המעקב החיסוני מתבסס מחדש לאחר פגיעה כלייתית חריפה. אנו משלבים קריוגנטיקה המושרה על ידי טמוקסיפן, אבלציה אינטרמדיליזין, ציטומטריית זרימה רב-פרמטרית ומיקרוסקופיה תוך-חיונית כדי להסיר, לעקוב ולדמיין מקרופאגים בכליות בזמן אמת.

האתגרים העיקריים הם הימנעות מדלקת מערכתית, התמקדות רק במקרופאגים תושבים ומדידת התחדשות מהירה מבלי להפריע לסביבה הכלייתית העדינה. הראינו שמונוציטים משחזרים 88% מהמקרופאגים בכליות תוך שבעה ימים לאחר האבלציה, תהליך התלוי באופן קריטי בציר האיתות CX3 CR1, CX3 CL1. כדי להתחיל, מחממים שמן תירס ל 42 מעלות צלזיוס.

ממיסים 100 מיליגרם טמוקסיפן בחמישה מיליליטר שמן תירס שחומם מראש להכנת תמיסת מלאי בריכוז של 20 מיליגרם למיליליטר. יש לתת טמוקסיפן תוך צפקי לעכברים זכרים בני 10 עד 12 שבועות במינון של 100 מיקרוגרם לגרם משקל גוף. לאחר 15 יום יש להזריק לעכברים מנה אחת תוך ורידית של אינטרמדיליזין במינון של 120 ננוגרם לגרם משקל גוף.

עקוב ואשר אבלציה של מקרופאגים מקומיים והתחדשות לאחר מכן על ידי ביצוע ציטומטריית זרימה לאחר יום, שלושה ושבעה ימים, לאחר מתן אינטרמדיליזין. לאיסוף כליות, השתמש במלקחיים עדינים ובמספריים כדי לבצע חתך אופקי באזור הבטן התחתונה של עכבר שעבר המתת חסד. הארך את החתך אנכית לאורך קו האמצע עד ממש מתחת לכלוב הצלעות או עצם החזה.

יש למשוך בעדינות את העור והשריר כדי לחשוף את חלל בית החזה. חותכים את האטריום הימני פתוח כדי לאפשר לדם להתנקז ממחזור הדם. הכנס מחט בגודל 21 עד 23 לחדר השמאלי.

התחל בזלוף עם 10 עד 20 מיליליטר PBS קר כדי לשטוף את הדם. המשך בזלוף עד שהכליות נראות חיוורות, מה שמעיד על פינוי דם יעיל. מקם את הכליות כנגד דופן הגוף הגבית, והפריד אותן בעדינות מהרקמות הסובבות באמצעות מלקחיים ומספריים.

יש להוציא את כמוסות הכליות ולהניח מיד את הכליות ב-PBS קר כדי למנוע התדרדרות. הכינו 100 מיליליטר קוקטייל אנזימי עיכול על ידי ערבוב HBSS ללא סידן ומגנזיום, קולגנאז IV ו-DNase I.הכינו את תמיסת האנזים טרייה, ושמרו אותה על קרח עד השימוש. בעזרת מספריים סטריליים, טחנו את הכליות לשברים זעירים בצלחת פטרי המכילה חמישה מיליליטר HBSS.

העבירו את רקמת הכליה הטחונה לצינורות של 15 מיליליטר המכילים 10 מיליליטר מתמיסת האנזים המוכנה. כעת דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם תסיסה עדינה כדי לנתק את הרקמה. יש לשלול בעדינות את הרקמה באמצעות פיפטה או בוכנת מזרק כדי לפרק עוד יותר את גושי התאים.

הסר פסולת על ידי העברת מתלה התא דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר. צנטריפוגה את מתלה התא ב 700 גרם למשך 10 דקות ב -18 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שפכו בזהירות את המאגר.

השעו מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של מאגר ליזה לפני הדגירה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות כדי ליז כדוריות דם אדומות. הוסף PBS כדי לשטוף את התאים ולהסיר את מאגר הליזיס. שמור על ההשעיה החד-תאית המתקבלת על קרח עד לשימוש נוסף.

עבור צנטריפוגה של שיפוע צפיפות, תחילה השעו מחדש את גלולת התא ב-10 מיליליטר של תמיסת שיפוע בצפיפות של 30%. שכב בזהירות את זה על פני שלושה מיליליטר של תמיסת שיפוע בצפיפות של 70% בצינור צנטריפוגה. צנטריפוגה את השיפוע ב -500 גרם למשך 30 דקות מבלי להחיל הפסקה.

לאחר צנטריפוגה, אסוף בזהירות את שכבת הממשק בין פתרונות 30% ל-70%. שוטפים את התאים שנאספו פעמיים עם 10 מיליליטר PBS, וצנטריפוגה כל שטיפה בחום של 500 גרם למשך 10 דקות. השעו מחדש את כדור התא הסופי במיליליטר אחד של מאגר FACS בצינור של 1.5 מיליליטר.

ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר תחת מיקרוסקופ שדה בהיר, והתאימו את ריכוז התאים לשניים כפול 10 בחזקת שישה תאים למיליליטר. גלולה את התאים בצינורות של 1.5 מיליליטר על ידי צנטריפוגה ב-650 גרם למשך חמש דקות, והשעיה מחדש של כדור התא במיליליטר אחד של מאגר FACS. הוסף נוגדן נגד CD 16 או 32 בדילול אחד עד 200 כדי לחסום קשירת קולטן FC לא ספציפית.

לאחר הדגירה של התאים במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, צבעו את התאים בצבע אקווה/מת וקוקטייל נוגדנים מצומד מראש, כולל CD45 E 450, CD11 B PE SI7, HCD59 PE ו-F4/80 BV 605. הוסף את קוקטייל הנוגדנים ישירות לתרחיף התא. דגרו את הדגימה למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך כדי להגן על פלואורופורים.

לאחר מכן שטפו את התאים פעמיים עם מאגר FACS. מקבעים את התאים ב-1% פרפורמלדהיד למשך 30 דקות על קרח. לאחר מכן שטפו את התאים פעמיים עם מאגר FACS כדי להסיר את הקיבוע הנותר.

רכוש תאים מוכתמים וקבועים באמצעות ציטומטר זרימה. נתח את הנתונים באמצעות התוכנה. זהה מקרופאגים ומיקרוגליה השוכנים בכליות וברקמות אחרות באמצעות הסמנים CD45, CD11B ו-F4/80.

בצע שער ראשוני לבחירת תאים חיים באמצעות פרופילי פיזור קדימה וצדדית. בטל כפילויות באמצעות שטח פיזור קדימה לעומת שער גובה. אל תכלול תאים מתים באמצעות צבע הכדאיות.

העשירו את תאי מערכת החיסון על ידי שער על אוכלוסיות חיוביות ל-CD45. הגדר מקרופאגים תושבי כליה כתאי CD11b+F4/80hi בתוך שער חיובי CD45 כפי שמוצג באסטרטגיית השער. הגדר אוכלוסיות מיקרוגליה כתאי ביניים CD11b+CD45, ובצע ניתוח סופי.

רצועת חלבון בולטת אחת נצפתה ליד 54 קילודלטון בג'ל הדף SDS, המאשרת את הטוהר והמשקל המולקולרי הצפוי של אינטרמדיליזין רקומביננטי. אינטרמדיליזין מטוהר הפגין פעילות המוליטית חזקה באופן תלוי מינון, והשיג ליזה של 50% תאי דם אדומים ב-7.24 ננוגרם למיליליטר, וליזה כמעט מלאה ב-650 ננוגרם למיליליטר. ניתוח ציטומטריית זרימה אישר דלדול מוצלח וסלקטיבי של מקרופאגים כלייתיים בעכברי cre-R אנושיים הניתנים להשראה CD59 יום לאחר מתן אינטרמדיליזין, ללא דלדול בעכברי הביקורת.

מקרופאגים כלייתיים החלו להתאכלס מחדש ביום השלישי, והתאוששו לכ-88% מאוכלוסייתם המקורית ביום השביעי. רק 5% מהמקרופאגים הכלייתיים שהתחדשו לאחרונה ביטאו CD59 אנושי עד היום השביעי, מה שמצביע על כך שהאכלוס מחדש התרחש בעיקר באמצעות גיוס מונוציטים ולא התפשטות באתרם.