מבחנים התנהגותיים למניפולציה אופטוגנטית של מעגלים עצביים בדרוזופילה מלנוגסטר

המחקר שלנו משתמש בכלים אופטוגנטיים כדי לחקור כיצד מעגלים עצביים בדרוזופילה מלנוגסטר שולטים בהתנהגויות, כמו תרמוטקסיס והריון. על ידי שליטה בתאי עצב ספציפיים באמצעות אור, אנו שואפים להבין כיצד מעגלים אלה מניעים תגובות חושיות ומשפיעים על קבלת החלטות בדיוק רב. אופטוגנטיקה היא טכנולוגיה רבת ערך במדעי המוח, המציעה שליטה מדויקת בפעילות העצבית באמצעות אור.

ב-Drosophila melanogaster, כלים כמו CsChrimson ו-GtACR2 מאפשרים הפעלה ועיכוב ממוקדים של נוירונים. כלים אלה מאפשרים לחוקרים לתפעל מעגלים עצביים, לחקור התנהגות ולחקור תגובות חיישנים עם ספציפיות גבוהה. הפרוטוקול שלנו מציע גישה פשוטה, חסכונית וניתנת לשחזור למניפולציה אופטוגנטית בדרוזופילה.

הוא משתמש בחומרים זמינים מסחרית, מה שהופך אותו לנגיש במעבדות ובכיתות עם משאבים מוגבלים. השיטות גם ניתנות להתאמה גבוהה, ומאפשרות לחקור התנהגויות אטרקטיביות והימנעות עם אתגרים טכניים מינימליים. כדי להתחיל, השג זבובי דרוזופילה זכרים ונקבות, המבטאים GtACR2 בתאי חימום.

יישר שני לוחות פלדה על פלטות חימום נפרדות כך שהקצוות שלהם ייפגשו. הניחו מגן יריעות פלסטיק מעל ואבטחו אותו עם סרט כדי למזער את התנועה. כעת, הנח פיסת נייר לבן על מגן הגיליון כדי להפחית את אותות רעשי הרקע, והנח כיסוי פלסטיק שקוף על גבי הנייר הלבן.

לאחר מכן חותכים חור בתחתית קופסת קצף פוליסטירן כדי להכיל את המצלמה והאור הכחול כ -12 סנטימטרים מעל פני הניסוי. מקם את המצלמה ואת האור הכחול כדי למזער סנוור, תוך הקפדה על הפעלה. הגדר את המצלמה להקליט עם קיטועי זמן של שנייה אחת, שדה צר ורזולוציה של 4,000 על 3,000 פיקסלים.

התאם את הגדרות משטח החימום כדי לשמור על טמפרטורת פני השטח של 25 פלוס מינוס מעלה צלזיוס אחת ו-31 פלוס מינוס מעלה צלזיוס אחת על לוחות הפלדה המתאימים. עקוב אחר הטמפרטורות של לוחות הפלדה באמצעות בדיקת טמפרטורת פני השטח לפני ואחרי כל ניסוי. לאחר מכן, הניחו את מכסה הפלסטיק על לוח הפלדה של 25 מעלות צלזיוס.

כעת, בעזרת שואב זבובים, שחרר בעדינות זבוב בודד מתחת לכיסוי. מקם את הקופסה מעל אזור הניסוי כדי ליצור אור עמום מתחת ל-10 לוקס, ותן לזבוב להתאקלם למשך דקה אחת. לאחר תקופת ההתאקלמות, הרם את הקופסה והתאם במהירות את מכסה הפלסטיק כך שמרכז הכיסוי יתיישר עם גבול לוח הפלדה.

התחל את הניסוי, הפעל את המצלמה ואת האור הכחול ב -20 קילולוקס. לכוד את פעילות הזבובים במשך שתי דקות. לאחר שתי דקות, כבה את המצלמה והאור.

השלך את הזבובים באמצעות השואב. זבובים זכרים ונקבות מורעבים מרדימים המבטאים CsChrimson בתאי עצב של קולטני טעם מתוק על קרח. מרחו שבע עד 10 נקודות דבק קטנות על שקופית זכוכית.

מקם צד גחון זבוב אחד כלפי מעלה על כל נקודת דבק, וודא שבית החזה והכנפיים באים במגע עם הדבק כדי למזער את התנועה. אווררו את הכנפיים לכל צד כדי להגדיל את שטח הפנים של הדבק. הניחו מגבות נייר רטובות בקופסת לחות והעבירו את השקופיות לקופסה.

לאחר שעתיים של התאוששות, הנח את השקופית מתחת למיקרוסקופ. השתמש במזרק כדי לספק טיפת מים כדי להשביע את הזבובים, ולמנוע הארכות פרובוסקיס הנגרמות על ידי צמא. החזק ידנית מצביע לייזר אדום והאיר אור אדום על הפרובוסקיס או על ראשו של זבוב בודד ב-700 לוקס.

התבונן בתגובת הארכת הפרובוסקיס דרך המיקרוסקופ בתוך חלון של 30 שניות. לאחר בדיקת הארכת הפרובוסקיס המושרה על ידי אור, בדוק את התגובה ל-4% סוכרוז. הוציאו טיפת סוכרוז בקצה מחט המזרק וקרבו אותה לחרטום הזבוב.

ראשית, הרכיבו את מבוך הזבובים לניסוי. בתנאי חושך או תאורה חלשה, הנח 10 זכרים ו-10 נקבות זבובים המבטאים CsChrimson לתוך צינור הטעינה וחבר אותו לתא ההחזקה. הטה את המעלית והקש בעדינות על הצינור כדי להעביר את הזבובים לתא ההחזקה.

לאחר העברת הזבובים לתא ההחזקה, השתמש במעלית כדי להוריד אותם בין צינור הטעינה לחורי צינור הבדיקה. ואז הסר את צינור הטעינה. מקם את מבוך הזבובים במרחק של כ-13 סנטימטרים ממקור האור האדום של 1,000 מיליאמפר מבלי להדליק את האור.

הורד את המעלית עד שתא האחיזה מתיישר עם חורי המבחנה, מה שמאפשר לזבובים לנוע בחופשיות בין המבחנות העטופות בנייר כסף והחשופות. במקביל, הפעל את האור האדום בכ-40 קילולוקס כדי להפעיל את CsChrimson. אפשרו לזבובים לבחור בין הצינור החשוף לאור האדום לבין הצינור המוצלל למשך דקה.

לאחר דקה אחת, הרם את המעלית בין צינור הטעינה לחורי צינור הבדיקה. הסר את הזבובים מכל צינור. ספרו אותם ורשמו את המספרים.

נקו את מעלית הזבובים ומבוך הזבובים באמצעות מים מזוקקים לאחר כל ניסוי. במבחן העדפת האור הכחול, האופטוגנטי, התרמו-טקטי והמיקום, הזבובים נמנעו מהצד של 31 מעלות צלזיוס בתנאי הביקורת, בעוד שבאור כחול עם תוספת ATR, הזבובים לא הראו העדפה בין 25 ל-31 מעלות צלזיוס, מה שמעיד על עיכוב נוירונים HC באמצעות הפעלת GtACR2. בתנאי ביקורת, זבובים הראו תגובה מינימלית להארכת פרובוסקיס, בעוד שהפעלת אור אדום עם תוספת ATR הביאה להרחבה משמעותית של פרובוסקיס, והדגימה את הפעלת נוירוני חישה מתוקה על ידי CsChrimson.

במבחן מבוך הזבובים באור אדום, אופטוגנטי, קבוצות הביקורת לא הראו העדפה, בעוד שהפעלת אור אדום עם תוספת ATR גרמה לזבובים להימנע מהצינור החשוף, מה שמצביע על הפעלת נוירונים בעלי חישה מרה על ידי CsChrimson.