בידוד, קיבוע ואפיון של לויקוציטים של ראש דניס צעיר על ידי ציטומטריית זרימה

פרוטוקול זה מתקנן את הבידוד, הקיבוע והערכת הכדאיות של לויקוציטים מכליה הראשית של דניס על ידי זרימה ציטומטרית, ומאפשר עיבוד דגימות בתפוקה גבוהה מבלי לפגוע באיכות.

טכניקות מסורתיות כמו ספירת תאים ידנית עם תאי נויבאואר ומריחות דם מוכתמות נפוצות באימונולוגיה של דגים. זרימה ציטומטרית הופכת פופולרית, אך יישומה במחקרי דגים נותר מוגבל. שיטות אימונולוגיה מסורתיות של דגים הן עתירות כבד ונוטות לטעויות. מחקרים בבעלי חיים צעירים מוגבלים על ידי אתגרים בהשגת לויקוציטים טהורים והצורך בהערכת כדאיות מיידית, המגבילים את תפוקת הדגימה.

פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מפורט של תאי מערכת החיסון על ידי זיהוי אוכלוסיות לויקוציטים מרכזיות והבחנה בין תאים חיים לתאים מתים. קיבוע שומר על כדאיות למשך חודש, ומאפשר זרימות עבודה מדרגיות, גמישות ויעילות של זרימות ציטומטריה.

הממצאים שלנו מקדמים את האימונולוגיה של הדגים על ידי חשיפת מנגנונים חיסוניים והשפעות סביבתיות על כדאיות התאים, ומסייעים בפיתוח אסטרטגיות משופרות לניהול מחלות בחקלאות ימית.

[קריין] כדי להתחיל, התאקלמו דניס זהוב צעיר, Sparus aurata, במערכות חקלאות ימית מחזוריות שבהן מים מסוננים וממוחזרים מחדש באופן רציף כדי לשמור על סביבה יציבה. ודא שהמערכת כוללת סינון מכני וביולוגי, אוורור ובקרת טמפרטורה כדי לשמור על פרמטרים אביוטיים אופטימליים. התאם גורמים סביבתיים כגון תקופת צילום, טמפרטורה, מליחות, pH ורמות חמצן מומס בהתאם לצרכים הספציפיים של המחקר. השתמש ברשת כדי להעביר בעדינות דגי דניס צעירים לתוך מיכל אחסון זמני מלא במי מיכל. לאחר המתת חסד של הדג, הניחו דג אחד על צדו על מגש חיתוך סטרילי. בעזרת אזמל, בצע חתך זהיר לאורך קו האמצע הגחוני של הדג מהאוורור לכיוון הזימים. השתמש במספריים לדיסקציה כדי להאריך את החתך ולחשוף את האיברים הפנימיים. אתר את כליית הראש, הממוקמת ממש מאחורי הזימים ליד האזור הגבי הקדמי של חלל הגוף, ומשתרעת לאורך הצד העליון מתחת לעמוד החוליות. בעזרת זוג מלקחיים ומספריים עדינים יש לנקות בזהירות את הרקמות שמסביב כדי לדמיין טוב יותר את כליית הראש. לאחר מכן הרם את כליית הראש ובצע חתכים מדויקים סביבה כדי לשחרר אותה מהרקמות שמסביב. הנח מיד את כליית הראש שנכרתה במסננת תאים הממוקמת בתוך צלחת פטרי סטרילית. פיפטה שני מיליליטר של תמיסת המלח המאוזנת של הנקס, או HBSS, בצלחת פטרי סטרילית. השרו את כליית הראש שנכרתה על מסננת התאים באמצעות בוכנה של מזרק כדי לשחרר את התאים לתמיסה. לאחר מכן, הכינו תמיסה בינונית של שיפוע צפיפות. פיפטה 600 מיקרוליטר של תמיסה בינונית שיפוע צפיפות לצינורות פוליסטירן עגולים עם תחתית עגולה של חמישה מיליליטר. העבירו לאט שני מיליליטר של תרחיף תאים מצלחת הפטרי לכל צינור. צנטריפוגה ב-400 גרם למשך 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס כשהבלם כבוי. לאחר הצנטריפוגה, הסר את הצינור והתבונן בטבעת הלויקוציטים. לאחר מכן השתמש בפיפטה סטרילית של פסטר כדי להעביר בעדינות כ-100 מיקרוליטר מטבעת הלויקוציטים לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר. כעת, השלימו את הנפח לשני מיליליטר עם HBSS והשעו בעדינות את התאים. צנטריפוגה את הדגימה ב-400 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, השליכו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור בתחתית הצינור. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה המטוהרת במיליליטר אחד של HBSS עד שריכוז התאים הסופי יהיה בין 10,000 למיליון תאים למיליליטר. הוסף 50 מיקרוליטר של דימתיל סולפוקסיד לבקבוקון המכיל את הצבע הריאקטיבי. לאחר התאמת צפיפות התא למיליון תאים למיליליטר, העבירו מיליליטר אחד של תרחיף התא לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר. הכן דוגמאות בקרת כדאיות כפי שניתן. לגרום למוות תאים בצינורות 3 ו-4 על ידי הנחתם באמבט מים בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך שבע דקות. כדי לצבוע את התאים, פיפטה מיקרוליטר אחד של הצבע הפלואורסצנטי המחודש לצינורות שניים וארבעה המכילים מיליליטר אחד של תרחיף תאים וערבבו היטב. דגרו את הצינורות המוכתמים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, מוגנים מפני אור. לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים עם מיליליטר אחד של HBSS, והשעו מחדש את הכדור הסופי ב -900 מיקרוליטר של אותו מאגר. ואז פיפטה 100 מיקרוליטר של 37% פורמלדהיד כדי לתקן את התאים, ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר שטיפת התאים פעמיים עם מיליליטר אחד של HBSS המכיל 1% BSA, יש להשעות במיליליטר אחד מאותה תמיסה. אחסן את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס במקרר עד חודש. הנח את צינור הדגימה הקבוע ביציאת הדגימה של ציטומטר הזרימה לניתוח. רשום מינימום של 10,000 אירועים עבור כל דגימה בתוך שער הסינגלטים. שמור את כל הנתונים וגבה אותם בכוננים חיצוניים או באחסון בענן. דמיין את נתוני ציטומטריית הזרימה על ידי התוויית אזור פיזור קדימה לעומת שטח פיזור צדדי כדי להעריך את גודל התא והגרעיניות. בצע שער תא בודד ואל תכלול מכפילים על ידי התוויית אזור פיזור קדימה לעומת גובה פיזור קדימה. זהה את שלוש אוכלוסיות הלויקוציטים על סמך פרופילי פיזור קדימה לעומת צד. הגדר את הסף לצביעת צבע כדאיות בתעלת הקרינה המתאימה כדי להבחין בין תאים חיים ומתים. בתנאים אופטימליים, לימפוציטים, מונוציטים וגרנולוציטים היוו 31%, 38% ו-31% מאוכלוסיית הלויקוציטים בהתאמה, בעוד שתחת לחץ תרמי, הלימפוציטים ירדו ל-21.3%, מונוציטים עלו ל-45.6% וגרנולוציטים נותרו יציבים על 33.1%. הדגימה שנחשפה לתנאים אופטימליים הראתה כדאיות גבוהה יותר, עם דומיננטיות של תאים חיים בכל אוכלוסיות הלויקוציטים. לעומת זאת, הדגימה הלחוצה תרמית הראתה עלייה משמעותית במוות התאים.