פרוטוקול ציטומטריית אלקטרופורציה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים חיים באמצעות תרבית תאים U2 OS

היקף מחקר זה מתמקד בהשפעת שדות חשמליים פועמים על התנהגות התא, במיוחד כיצד אלקטרופורציה משפיעה על מחזור התא.

היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא היכולת לבצע ניסויי אלקטרופורציה רציפים של תאים חיים באמצעות תרבית תאים של יונקים עד 72 שעות. המעבדה שלנו מתמקדת בהתאמת טכניקות אלה למיקרופלואידיקה, מה שיאפשר גדלי דגימות נמוכים יותר, דרישות ריאגנטים מופחתות ובקרת דגימה טובה יותר לפרוטוקולים עתידיים.

[קריין] כדי להתחיל, תרבית תאי U2OS FUCCI CA5 בצלחת של 10 סנטימטר עם 10 מיליליטר של גלוקוז גבוה DMEM המכיל 10% FBS ו-1% סטרפטומיצין פניצילין. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בסביבה של 5% פחמן דו חמצני. כאשר התרבות מגיעה למפגש של 80%, שאפו את המדיה מהצלחת. שטפו את התאים עם PBS ואז הוסיפו מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין ודגרו למשך 1.5 דקות כדי לנתק את התאים. נטרל את הטריפסין על ידי השעיית התאים המנותקים בחמישה מיליליטר של גלוקוז גבוה DMEM. השג דגימה של 100 מיקרוליטר מהתרבית המושעה והנח אותה על החלקת מכסה הזכוכית התחתונה בתוך תא מערכת הציטומטריה של האלקטרופורציה. ודא שהתא מתכנס ב-30% לאחר הכנסת הדגימה. הוסף לאט ארבעה מיליליטר של גלוקוז גבוה DMEM לקצה הרחוק של החדר, ומונע מהנוזל לשטוף את הדגימה. הנח שקופית מיקרוסקופ רגילה מעל החדר ודגר את החדר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות. הפעל את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי ההפוך עם תא בקרה סביבתי כדי לאפשר למערכת להתייצב לפני האלקטרופורציה. בזמן שהתא הסביבתי מתייצב, השתמש בכבלי קליפ תנין כדי לחבר מולטימטר דיגיטלי לקבל מחולל הדופק ולמתג מתח גבוה להתקנה מהירה עם תא האלקטרופורציה. כעת, בחר הגדלה פי 20 במיקרוסקופ. בתוכנת המיקרוסקופ, ודא שתעלות FITC/GFP ו-A594 Texas Red M Cherry נבחרות המתאימות לשני החלבונים הפלואורסצנטיים במערכת FUCCI CA5. השתמש בהגדרות חשיפה נמוכה, בדרך כלל פחות מ-0.05 שניות, כדי למנוע נזק לתמונה במהלך הדמיה לטווח ארוך. צלם תמונות מבחן כדי לייעל את המיקוד והאיכות של התמונה לפני שתתחיל את הדמיית דולג הזמן. תכנת את הזמן לשגות כדי ללכוד תמונות משלוש עד שש נקודות מבט שונות כל 10 דקות לאורך תקופה של 24 שעות כדי להשיג נפח גבוה של נתוני מחזור תא לכל זמן לשגות תוך הפחתת נזק לצילום. ודא שהמיקוד האוטומטי מופעל עבור ערוץ A594 כדי למטב את המעקב אחר תרבית במהלך קיטועי הזמן. השאר את התוכנה פתוחה עד להשלמת האלקטרופורציה. הנח את תא הציטומטריה האלקטרופורציה במיקרוסקופ המצויד בתא סביבתי מתאים. לפני האלקטרופורציה, שמור את התא סגור וודא שהמערכת הסביבתית ממשיכה לפעול כדי לשמור על תנאי מחזור תאים נאותים. פתח את החדר הסביבתי וחבר מולטימטר דיגיטלי למחולל הדופק, ואז בעזרת כבלי קליפ תנין, חבר את מחולל הדופק לאלקטרודות החדר. טען את קבל מחולל הדופק ל -180 וולט. שחרר את הדופק לתא במהירות עד שהמולטימטר הדיגיטלי יציג אפס וולט. הסר את כל החיבורים החשמליים מהתא והחלף מיד את מכסה התא כדי להבטיח תנאי תרבות מיטביים. הפעל את הדמיית ה-time lapse מיד לאחר שתא הסביבה נמצא במקומו היטב. לאחר השלמת חלוף הזמן, השתמש בתוכנת המיקרוסקופ כדי לשמור את כל התמונות שצולמו כסרטון יחיד. התאם את האיכות החזותית כדי לשפר את הבהירות של תכונות התא לצורך כימות ידני. לבסוף, שים לב לשינויים באותות FITC ו-A594 לאורך זמן כדי לעקוב אחר שלבי התא בסרטון ה-time lapse. באמצעות מערכת פוג'י, נתונים חזותיים נאספו על ידי מעקב אחר שינויי צבע הקשורים לביטוי חלבון ובכל מקום, מה שמאפשר הבחנה ברורה בין שלבי G1, S, G2, M. זה איפשר תצפית ישירה על התקדמות מחזור התא בתנאים משתנים. איור זה מספק סיכום של נתוני המפתח שנאספו משתי קבוצות של ניסויים באמצעות תרביות תאים לא מסונכרנות ומסונכרנות בשלב S. חשיפה לשדה חשמלי פועם בתאים לא מסונכרנים הגדילה משמעותית את האורך הממוצע של פאזות G1, G2 ו-M, בעוד ששלב S נותר ללא שינוי. בתאים מסונכרנים, חשיפה לשדה חשמלי פועם הובילה למשכים מופחתים של פאזות G1, S ו-G2, אם כי רק S ו-G2 היו מובהקים סטטיסטית, בעוד ששלב M נותר ללא השפעה.