הכנה ותחזוקה של ניסוי כלוב איזופוזיטיבי להדרה ביולוגית להשתלת צואה אנושית בעכברים נטולי חיידקים
28 בפברואר 2025
פרוטוקול זה מתאר את השיטות המומלצות להעברת עכברים ללא חיידקים למבודדים ניסיוניים בכלוב יחיד (איזוקאז'ים) תוך שמירה על תנאים סטריליים. נדונות שיטות להשתלת צואה בעכברים נטולי חיידקים ואיסוף חיידקים ברי קיימא מעכברים "אנושיים" אלה ליישומים נוספים.
חקרנו את האינטראקציה בין חיידקים למארח, והגורם הפנימי והחיצוני שלנו שינה את הקשר הזה כדי לשנות את הבריאות. באופן ספציפי, אנו מעוניינים להבין את תפקידם של חיידקים בהתפתחות, התקדמות וטיפולים בסרטן. אנו ומעבדות מיקרוביום אחרות משתמשות במערכת כלובים חיובית ISO כדי להעביר קהילה צואתית מנבדק אנושי למארח עכברי מקבל כדי ליצור קהילה מיקרוביאלית יציבה וארוכת טווח.
טכנולוגיה זו אפשרה לנו לייצר תגלית חדשה על תפקידם של חיידקים קליניים רלוונטיים בבריאות ובחולי. ניסויים קליניים פרוספקטיביים רבים מצאו קשרים בין חיידקים ספציפיים להתפתחות סרטן, התקדמות ותגובה לטיפול, אך מתאם אינו מרמז על סיבתיות. האנשה של עכברים נטולי חיידקים עם דגימות צואה אנושיות מאפשרת לאמת קשר סיבתי במודלים רלוונטיים של סרטן.
באמצעות מערכת הכלוב החיובי ISO, הראינו כי זנים ספציפיים של בקטרואידים ממגיבים לאימונותרפיה אנושית, חולי סרטן ריאות של תאים לא קטנים מעניקים תגובה לעכברים הנושאים גידולי ריאה אורתוטופיים. כדי להתחיל, הכניסו 10 מגבונים למיכל הטבילה הסטרילנטי של כלור דו חמצני וודאו שהם סבונים במלואם. לאחר מכן, בעזרת גליל מדורג, מלאו שקית ניילון גדולה בלפחות 100 מיליליטר של מעקר כלור דו חמצני.
יש לנער את השקית כדי לוודא שכל המשטחים הפנימיים ספוגים ולהניח אותה בצד. הסר כלוב ISO יחיד מהמתלה והנח אותו במיכל הטבילה המעקר כלור דו חמצני, תוך הבטחת מגע מלא עם נוזלים. השתמש במגבונים ספוגים כדי לקרצף את כל משטחי הכלוב.
לאחר השריית הכלוב, בקש מעוזר לפתוח את שקית הניילון הספוגה. הנח את הכלוב בפנים וסגור מיד את הפתח. בעזרת בקבוק ריסוס יש לרסס את פתח השקית בחומר מעקר כלור דו חמצני.
לאחר שכל הכלובים והאספקה ארוזים, טבלו כפפות עמידות לכימיקלים בחומר מעקר כלור דו חמצני. בינתיים, העבירו את המגבונים הספוגים לארון הבטיחות הביולוגית והשרו את כל המשטחים. עבור משטחים לא מוגנים, סחטו עליהם את המגבונים מבלי לגעת בהם.
לאחר 20 דקות, באמצעות כפפות מעוקרות עמידות לכימיקלים, העבירו כל כלוב ובקבוק לארון הבטיחות הביולוגית המעוקר. כדי לפתוח את כלוב ה-ISO האטום הרמטית, הרם את הלשוניות הלבנות בשני המהדקים בצידי המכסה ומשוך החוצה כל מהדק הצידה כדי לפתוח את המכסה. בעזרת המלקחיים הסטריליים בתוך הכלוב על גבי מתלה החוט, הסר את בקבוק המים הריק והנח אותו בחלק הפנימי של המכסה.
הסר את אטם הגומי ושפך מים לבקבוק כדי למלא אותו. בעזרת מלקחיים סטריליים, הנח את הזרבובית על בקבוק המים ולחץ כלפי מטה בחוזקה כדי לאטום. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים סטריליים, הרם את מתלה החוט והחלק אותו לאחור כמה סנטימטרים כדי ליצור פתח לתחתית הכלוב.
הנח את המלקחיים הסטריליים על מתלה החוט, וודא שהידיות לא יבואו במגע עם משטחי הכלוב. עם קבלת דיסק ההעברה, בקש מהעוזר להחזיק ולפרוק חלקית את מכסה הפלסטיק כך שהמשטח הספוג ייחשף אך לא ייגע בו. לבישת כפפות עמידות לכימיקלים ספוגות בסטרילנט כלור דו חמצני, הסר את דיסק ההעברה מעטיפת הפלסטיק והנח אותו על משטח ישר בתוך ארון הבטיחות הביולוגית המעוקר.
כדי לפתוח את דיסק ההעברה, קלף את הסרט האוטם את היקף הדיסק ולאחר מכן הסר את המכסה. לאחר מכן, בעזרת המלקחיים הסטריליים שהונחו קודם לכן על מתלה החוט, תפעל את מכסה התא כדי ליישר את הפתח עם העכבר שיש להעביר. באמצעות מלקחיים סטריליים, אחוז בבסיס זנב העכבר דרך הפתח במכסה דיסק ההעברה, הרם והעביר את העכבר לכלוב ISO דרך הפתח שבין מתלה החוט לכלוב.
לאחר העברת כל העכברים, החלף את מתלה החוט במלקחיים הסטריליים. הרם את מכסה הכלוב והנח אותו בחזרה על גבי הכלוב. הרם כל מהדק של מכסה הכלוב כלפי מעלה והורד אותו בזהירות מעל דפנות הכלוב.
דחוף כלפי מטה את הלשוניות הלבנות כדי לאטום היטב את מכסה הכלוב. כעת, בקש מהעוזר לרסס כל זרבובית של אתר העגינה על מתלה הכלוב בחומר חיטוי כלור דו חמצני. הסר את הכלוב מארון הבטיחות הביולוגית ועגן אותו על מתלה הכלוב.
שחר חלוק כירורגי סטרילי חדש וכפפות כירורגיות סטריליות במקום הכפפות העמידות לכימיקלים. כדי להכין את מחטי הגוואג', פרקו כל שקית עיקור והשתמשו בחלק הפנימי של השקית כמשטח מנוחה סטרילי יבש. חבר את מחט הגוואג' למזרק.
פתח את צינור התרחיץ הצואתי ומשוך 200 מיקרוליטר של התרחיץ לכל מזרק. בעזרת מלקחיים, אחוז בבסיס זנב העכבר והנח אותו על מתלה החוט. רסנו בעדינות את העכבר על ידי שפשוף העור הרפוי מאחורי הצוואר.
תוך כדי החזקת העכבר במצב אנכי זקוף, הכנס את מחט הגאווג' והזריק בעדינות את תרחיץ הצואה. הסר מיד את המחט לאחר ההזרקה. הנח את העכבר ישירות לתוך אחת הכוסות המעוקרות להשגחה.
לאחר שכל העכברים קיבלו את הגוואג', השתמשו במלקחיים כדי להחזיר כל עכבר למיטת הכלוב. מבנה קהילת הצואה של העכברים המואנשים היה שונה באופן משמעותי בין פנוטיפים של תגובה בכל שלוש נקודות הזמן. עכברי הצואה המגיבים לא הראו הבדל במבנה הקהילה המיקרוביאלית בין שבוע ראשון לשבוע שני, ושבוע שני ושבוע רביעי.
בעוד שצואה שלא מגיבה, עכברים שהתיישבו הראו מבנה קהילתי מיקרוביאלי שונה בין השבוע הראשון לשבוע השני, אך מבנה דומה בין השבוע השני לשבוע הרביעי. החיסונים מתורמים אנושיים הראו ייצוג מוגבר של Blautia, Eubacterium, ruminococcus ו-Streptococcus, בעוד שבעכברים המקבלים היה שפע יחסי מוגבר של בקטרואידים, Lachnoclostridium, Marvinbryantia ו-Parabecteroides.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט את שיטות העבודה המומלצות להעברת עכברים נקיים מחיידקים (germ-free) למבודדים בודדים (single-cage isolators) לצורכי ניסוי, תוך הבטחת תנאים סטריליים. כמו כן, הוא דן בשיטות להשתלת צואה לעכברים נקיים מחיידקים ובאיסוף חיידקים חיוניים ליישומים נוספים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מחקר מיקרוביום
- מודלים של בעלי חיים נקיים מחיידקים (Germ-free)
- ביולוגיה של הסרטן
רקע
- הבנת האינטראקציה בין חיידקים לבין המארח היא קריטית לבריאות.
- מיקרובים ספציפיים נקשרו להתפתחות סרטן ולתגובה לטיפול.
- הומניזציה של עכברים נטולי חיידקים (germ-free) מאפשרת תיקוף של קשרי סיבתיות במודלים של סרטן.
- מערכות כלובים חיוביות ל-ISO מקלות על העברת קהילות צואה מבני אדם לעכברים.
מטרת המחקר
- לבחון את תפקיד החיידקים בהתקדמות הסרטן ובטיפולים תרפויטיים.
- ליצור קהילות מיקרוביאליות יציבות במארחים עכבריים.
- לאמת קשרים בין מיקרובים ספציפיים לתוצאות של מחלת הסרטן.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- העברה של קהילות צואה מנבדקים בני אדם לעכברים נקיים מחיידקים (germ-free).
- שימוש במערכות כלובים חיוביות ISO לשמירה על תנאים סטריליים.
- איסוף חיידקים חיוניים מעכברים הומניזיים.
- השכנה ארוכת טווח של עכברים לחקר יציבות הקהילה המיקרוביאלית.
תוצאות עיקריות
- ביסוס של קהילות מיקרוביאליות יציבות בעכברים מקבלים.
- זיהוי חיידקים קליניים הרלוונטיים לבריאות ולמחלה.
- תובנות לגבי תפקידם של מיקרובים ספציפיים בהתפתחות סרטן.
- תיקוף של קשרי סיבתיות במודלים של סרטן.
מסקנות
- המחקר מדגים את חשיבותו של המיקרוביום במחקר הסרטן.
- עכברים נקיים מחיידקים (germ-free) המהומנזים הם בעלי ערך להבנת ההשפעות המיקרוביאליות על הבריאות.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על ממצאים אלו כדי לבחון השלכות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
השתלת צואה אנושית לעכברים נקיים מחיידקים (germ-free) באמצעות כלובים מסוג bioexclusion IsoPositive מאפשרת בחינה ישירה של הקשר הסיבתי של המיקרוביום במודלים פרה-קליניים רלוונטיים למחלה. גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים וביטחון חיזוי עבור אסטרטגיות טיפוליות המכוונות למיקרוביום, במיוחד במחקר בתחומי האונקולוגיה והאימונותרפיה. יכולת ההרחבה והסטריליזציה של המערכת מקלות על המשכיות תרגומית (translational continuity) חזקה משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר תיקוף פונקציונלי של טקסונים מיקרוביאליים מועמדים המעורבים בהתקדמות מחלה או בתגובה טיפולית.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי בידוד השפעות המיקרוביום בסביבות מאכסן מבוקרות.
- מקל על חקירה מונחית-השערה של אינטראקציות מאכסן-מיקרובה הרלוונטיות לבחירת מטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מודלים סטנדרטיים וניתנים לשחזור של עכברים הומניים לסריקת תרכובות או התערבויות בהמשך התהליך.
- מבטיח מדידה כמותית ואורכית של יציבות הקהילה המיקרוביאלית לאחר השתלה.
- מאפשר פיתוח של בדיקות לסוכנים המשפיעים על המיקרוביום במערכת מבוקרת ונקיים מזיהומים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים פרה-קליניים להרכב המיקרוביום האנושי לשיפור הרלוונטיות התרגומית.
- תומך בקידום מותאם-סיכון של טיפולים המכוונים למיקרוביום באמצעות תיקוף סיבתיות in vivo.
- מאפשר איסוף של צואה חיה מעכברים עם מערכת חיסונית אנושית (humanized) לצורך מחקרים פונקציונליים או מכניסטיים נוספים.
שילוב בקו התהליך (Pipeline) ובזרימת העבודה
שיטה זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים לבין תיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות להשתבת (engraftment) מבוקרת של מיקרוביום אנושי במודלים עכבריים, ובכך היא תומכת הן בתיקוף של מטרות (target validation) והן במחקר תרגומי.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות בנוגע לתרומת המיקרוביום לפנוטיפים של מחלות ולתוצאים טיפוליים.
- סריקה: מספקת פלטפורמה הניתנת לשחזור להערכת התערבויות המשנות את המיקרוביום.
- אנליטיקה: מספקת תוצאות כמותיות של הרכב קהילת המיקרוביום ויציבותה לאורך זמן.
- מחקר תרגומי: מבטיחה רצף בין ממצאים קליניים בבני אדם לבין תיקוף במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת תהליך עבודה סטנדרטי וניתן להרחבה למחקרים חוזרים של השתלת מיקרוביום.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר ופיתוח המכוונים למיקרוביום.
- ערך תפעולי: מייעל את הטיפול הסטרילי ואת המניפולציה הניסויית, ובכך מפחית עלויות ועומס על המתקנים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת (go/no-go) תוכניות טיפוליות מבוססות מיקרוביום.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות והתערבויות במיקרוביום בהתאמה לרמת הסיכון.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בגידול בעלי חיים גנוטוביוטיים ובטכניקה סטרילית.
- נדרשת גישה למערכות כלובים מסוג IsoPositive ולפרוטוקולי סטריליזציה שעברו תיקוף.
- נדרשת סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לניטור זיהומים ואישור סטטוס.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה עבור מיקרוביוטות תורמים שונות או מודלים של מחלות.
- המגבלות כוללות צורך בתשתית ייעודית והבטחת סטריליות שוטפת.
