ויסות כימוגנטי בתאי קודמן שמקורם בתאי גזע מתוכנתים מחדש בטיפול במחלות נוירודגנרטיביות

המחקר שלנו מתמקד בהמחשת המנגנון הפתוגני העומד בבסיס מחלות נוירודגנרטיביות, תוך שילוב טכנולוגיות מתקדמות לפיתוח טכניקות טיפול תאי יעילות ליישומים קליניים. עבודתנו האחרונה השתילה תאי גזע מהונדסים כימוגנטית במודלים של עכברי מחלת פרקינסון. אנו מווסתים את פעילות הנוירונים של תא אחד באמצעות תרופות מעצבים, כך ניטור אלקטרופיזיולוגי והערכה התנהגותית. אנו משתמשים בעיקר ב-CRISPR להנדסה גנטית, אלקטרופיזיולוגיה לניטור פעילות עצבית ובדיקה התנהגותית להערכת התאוששות תפקוד במודלים של מחלת פרקינסון. היעילות של תאי השתל עולה על התוויה נכונה, הישרדות ותרומה תפקודית לרקמת המארח בטיפול מבוסס תאי גזע, לטיפול במחלות ניווניות. פעילות תאית בלתי מבוקרת הקשורה להשלכות שליליות, כולל היווצרות גידול.

מינוף הטכנולוגיה בתאי גזע אנושיים מתוכנתים מחדש ונוירונים מניעים מספק את האמצעים לשליטה מדויקת בפעילויות עצביות באמצעות מתן תרופת המעצב CNO.

[מדריך] כדי להתחיל, ערבבו בעדינות 50 עד 100 ננוגרם של הווקטור הליניארי, חתכו אחד ושברו שניים, ביחס מולארי של אחד עד שלוש עד שלוש, יחד עם תערובת שיבוט פי 2. דגרו את התערובת בחום של 55 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי להקל על רקומבינציה הומולוגית באמצעות הרכבת גיבסון. הכנס את ה-RNA המנחה המכוון לאתר AAVS1 לאתר BBS1 של וקטור PX458. שמור על תאי הגזע המתוכנתים מחדש במצע תרבית, במטרה להגיע לצפיפות תאים בין 2 ל-5 מיליון תאים למיליליטר. כעת, ערבבו שניים עד 5 מיליון תאים, שני מיקרוגרם מכל פלסמיד תורם ושני מיקרוגרם של פלסמיד GRNA ב-100 מיקרוליטר של מאגר אלקטרופורציה. העבירו את תערובת התאים והפלסמיד לקובטה לביצוע אלקטרופורציה. לאחר מכן, העבירו את התאים האלקטרופורטיים ללוחות של שש בארות שצופו בפולי-D-ליזין ולמינין. מחלקים כ -500,000 תאים לבאר בשני מיליליטר של מדיום תרבית. לאחר 72 שעות של אלקטרופורציה, השתמש בציטומטר זרימה כדי למיין תאים חיוביים פלואורסצנטיים. הגדר את הסדרן עם ערוץ FITC לזיהוי ZsGreen. כלול תאי גזע עצביים מושרים לא מטופלים כבקרות שליליות להגדרת הקרינה הבסיסית. צלחת תאים בודדים חיוביים ZsGreen לצלחות של 96 בארות מצופות מראש בפולי-D-ליזין ולמינין והוסיפו 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית לבאר. שמרו על התרבות במשך שבעה עד 14 יום. בודד שיבוטים בודדים המציגים פלואורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המצויד בסט מסנני חלבון פלואורסצנטי ירוק. לאחר הרחבת התאים החיוביים על צלחות מצופות של 48 בארות, פצלו אותם לשני חלקים, האחד להמשך תרבית והשני לגנוטיפ. חלץ DNA גנומי מהשיבוטים המועמדים. הכינו תערובת PCR באמצעות שני תיקונים ראשוניים, אחד כדי לאשר את החדרת הגן המבוקש, והשני כדי להבחין בין שיבוטים הומוזיגוטיים והטרוזיגוטים. עכל את התאים, שטוף אותם ב- PBS וצנטריפוגה בחום של 250 גרם למשך שלוש דקות. בצע זריקות סטריאוטקסיות חד צדדיות של שלושה מיקרוליטרים של 6-הידרוקסידופמין בריכוז של חמישה מיקרוגרם למיקרוליטר על החיה המורדמת. כוון לקורפוס סטריאטום הימני באמצעות הקואורדינטות הנכונות. יש לתת זריקה תוך-צפקית של אפומורפין במיליגרם אחד לק"ג באמצעות תמיסה של 0.5 מיליגרם למיליליטר המומסת במי מלח ארבעה שבועות לאחר הניתוח כדי לאמת את הנגעים. לתת זריקה סטריאוטקסית של ארבעה מיקרוליטרים של תרחיף התאים המוכן למודל העכבר של מחלת הפרקינסון. בצע את בדיקת הצילינדר במספר נקודות זמן לאחר השתלת תאים. הניחו זכוכית בקוטר 20 ס"מ וגובה 30 ס"מ על משטח שטוח ולא מחזיר אור. לאחר מכן, מקם מצלמת תצוגה עליונה מעל הגליל כדי ללכוד את הקוטר המלא. הנח כל עכבר במרכז הגליל והתחל הקלטת וידאו בו זמנית למשך שלוש דקות בכל הפעלה. לאחר ההפעלה, החזר את העכבר לכלוב הביתי שלו. העריכו את תנועת הגפיים העליונות של העכברים במהלך הפגישה בת שלוש הדקות. חשב את מספר מגעי הקיר שנוצרו על ידי הגפה הקדמית הפגומה ביחס לסך המגעים שנוצרו על ידי שתי הגפיים הקדמיות. יש לתת מי מלח או תחמוצת Clozapine N במינון של 1.2 מיליגרם לק"ג באמצעות הזרקה תוך-צפקית. בצע שוב את בדיקת הצילינדר כדי להעריך אפנון התנהגותי במודל העכבר של מחלת פרקינסון לאחר מתן קלוזפין N-oxide. לאחר חילוץ המוח מהחיה המורדמת, והנח אותו מיד בנוזל מוחי מלאכותי על בסיס סוכרוז קר כקרח כדי לשמור על שלמות התא בעזרת ויברטום, פורסים את המוח למקטעים בעובי של 300 עד 400 מיקרומטר. התאם את הגדרות כניסת הגז כדי לאזן עם 95% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני ב-34 מעלות צלזיוס. העבירו את פרוסות המוח לחדר מלא בנוזל מוחי מלאכותי. טען פיפטות זכוכית בתמיסה תוך-תאית קרה, מה שמבטיח התנגדות אלקטרודה בין שבעה ל-10 מגה-הם. הרכיבו פרוסות בתא הקלטה שקוע בטמפרטורה של שני מיליליטר לדקה עם נוזל מוחי מלאכותי מחומצן ב-34 מעלות צלזיוס. מקם פיפטות באמצעות מיקרומניפולטורים ממונעים תחת מיקרוסקופ ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות אינפרא אדום. קבע תצורת תא שלם באמצעות יניקה עדינה כדי לתקן נוירונים עם התנגדות של יותר מג'יגה-אוהם אחד. מהדקים את התאים במינוס 70 מילי-וולט באמצעות מגבר מהדק תיקון ורכשו זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים ספונטניים בסיסיים למשך שמונה דקות בקצב דגימה של 10 קילו-הרץ. הוסף 50 תחמוצת N קלוזפין מיקרו-מולרית לתא ההקלטה מיד לאחר המדידה הבסיסית. המשך להקליט נתונים למשך 16 דקות ועקוב אחר שינויים בתדירות או במשרעת זרם פוסט-סינפטי מעורר ספונטני. לבסוף, בצע הליך שטיפה על ידי החלפת תמיסת תחמוצת ה-N של קלוזפין בנוזל מוחי מלאכותי טרי והמשך בהקלטה כדי להעריך את ההתאוששות בפעילות הסינפטית. אפנון המוגני באמצעות תחמוצת N-clozapine הפחית את תנועת הגפיים הקדמיות הנגדיות בעכברים מושתלים ב-hM4Di והגדיל אותה בעכברים מושתלים ב-hM3Dq בהשוואה לטיפול במי מלח, מה שמדגים שליטה התנהגותית דו-כיוונית. רישומים אלקטרופיזיולוגיים גילו כי לתאים שהושתלו ב-hM4Di היו מרווחים ארוכים יותר ומשרעות שיא קטנות יותר בזרמים פוסט-סינפטיים מעוררים ספונטניים, בעוד שלתאים מושתלים hM3Dq היו מרווחים קצרים יותר ואמפליטודות גדולות יותר, מה שמעיד על דיכוי ושיפור בהתאמה של הפעילות הסינפטית. ניתוח אימונופלואורסצנטי אישר את הביטוי in vivo של טירוזין הידרוקסילאז ו-ZsGreen בתאי hM4Di ו-hM3Dq המושתלים, ותמך באינטגרציה מוצלחת של השתל.