ויסות כימוגנטי בתאי קודמן שמקורם בתאי גזע מתוכנתים מחדש בטיפול במחלות נוירודגנרטיביות
2 במאי 2025
כאן, אנו מתארים פרוטוקול להנדסת תאי גזע שתוכנתו מחדש כימית כדי להשיג אפנון עצבי מדויק על ידי התמיינות תאים אלה לתאים קודמים דופמינרגיים, השתלתם במודלים של עכברים של מחלת פרקינסון, והערכת תוצאות התנהגותיות ואלקטרופיזיולוגיות כדי לאשר את האינטגרציה המוצלחת והיעילות התפקודית של התאים המושתלים.
המחקר שלנו מתמקד בהמחשת המנגנון הפתוגני העומד בבסיס מחלות נוירודגנרטיביות, תוך שילוב טכנולוגיות מתקדמות לפיתוח טכניקות טיפול תאי יעילות ליישומים קליניים. עבודתנו האחרונה השתילה תאי גזע מהונדסים כימוגנטית במודלים של עכברי מחלת פרקינסון. אנו מווסתים את פעילות הנוירונים של תא אחד באמצעות תרופות מעצבים, כך ניטור אלקטרופיזיולוגי והערכה התנהגותית. אנו משתמשים בעיקר ב-CRISPR להנדסה גנטית, אלקטרופיזיולוגיה לניטור פעילות עצבית ובדיקה התנהגותית להערכת התאוששות תפקוד במודלים של מחלת פרקינסון. היעילות של תאי השתל עולה על התוויה נכונה, הישרדות ותרומה תפקודית לרקמת המארח בטיפול מבוסס תאי גזע, לטיפול במחלות ניווניות. פעילות תאית בלתי מבוקרת הקשורה להשלכות שליליות, כולל היווצרות גידול.
מינוף הטכנולוגיה בתאי גזע אנושיים מתוכנתים מחדש ונוירונים מניעים מספק את האמצעים לשליטה מדויקת בפעילויות עצביות באמצעות מתן תרופת המעצב CNO.
[מדריך] כדי להתחיל, ערבבו בעדינות 50 עד 100 ננוגרם של הווקטור הליניארי, חתכו אחד ושברו שניים, ביחס מולארי של אחד עד שלוש עד שלוש, יחד עם תערובת שיבוט פי 2. דגרו את התערובת בחום של 55 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי להקל על רקומבינציה הומולוגית באמצעות הרכבת גיבסון. הכנס את ה-RNA המנחה המכוון לאתר AAVS1 לאתר BBS1 של וקטור PX458. שמור על תאי הגזע המתוכנתים מחדש במצע תרבית, במטרה להגיע לצפיפות תאים בין 2 ל-5 מיליון תאים למיליליטר. כעת, ערבבו שניים עד 5 מיליון תאים, שני מיקרוגרם מכל פלסמיד תורם ושני מיקרוגרם של פלסמיד GRNA ב-100 מיקרוליטר של מאגר אלקטרופורציה. העבירו את תערובת התאים והפלסמיד לקובטה לביצוע אלקטרופורציה. לאחר מכן, העבירו את התאים האלקטרופורטיים ללוחות של שש בארות שצופו בפולי-D-ליזין ולמינין. מחלקים כ -500,000 תאים לבאר בשני מיליליטר של מדיום תרבית. לאחר 72 שעות של אלקטרופורציה, השתמש בציטומטר זרימה כדי למיין תאים חיוביים פלואורסצנטיים. הגדר את הסדרן עם ערוץ FITC לזיהוי ZsGreen. כלול תאי גזע עצביים מושרים לא מטופלים כבקרות שליליות להגדרת הקרינה הבסיסית. צלחת תאים בודדים חיוביים ZsGreen לצלחות של 96 בארות מצופות מראש בפולי-D-ליזין ולמינין והוסיפו 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית לבאר. שמרו על התרבות במשך שבעה עד 14 יום. בודד שיבוטים בודדים המציגים פלואורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המצויד בסט מסנני חלבון פלואורסצנטי ירוק. לאחר הרחבת התאים החיוביים על צלחות מצופות של 48 בארות, פצלו אותם לשני חלקים, האחד להמשך תרבית והשני לגנוטיפ. חלץ DNA גנומי מהשיבוטים המועמדים. הכינו תערובת PCR באמצעות שני תיקונים ראשוניים, אחד כדי לאשר את החדרת הגן המבוקש, והשני כדי להבחין בין שיבוטים הומוזיגוטיים והטרוזיגוטים. עכל את התאים, שטוף אותם ב- PBS וצנטריפוגה בחום של 250 גרם למשך שלוש דקות. בצע זריקות סטריאוטקסיות חד צדדיות של שלושה מיקרוליטרים של 6-הידרוקסידופמין בריכוז של חמישה מיקרוגרם למיקרוליטר על החיה המורדמת. כוון לקורפוס סטריאטום הימני באמצעות הקואורדינטות הנכונות. יש לתת זריקה תוך-צפקית של אפומורפין במיליגרם אחד לק"ג באמצעות תמיסה של 0.5 מיליגרם למיליליטר המומסת במי מלח ארבעה שבועות לאחר הניתוח כדי לאמת את הנגעים. לתת זריקה סטריאוטקסית של ארבעה מיקרוליטרים של תרחיף התאים המוכן למודל העכבר של מחלת הפרקינסון. בצע את בדיקת הצילינדר במספר נקודות זמן לאחר השתלת תאים. הניחו זכוכית בקוטר 20 ס"מ וגובה 30 ס"מ על משטח שטוח ולא מחזיר אור. לאחר מכן, מקם מצלמת תצוגה עליונה מעל הגליל כדי ללכוד את הקוטר המלא. הנח כל עכבר במרכז הגליל והתחל הקלטת וידאו בו זמנית למשך שלוש דקות בכל הפעלה. לאחר ההפעלה, החזר את העכבר לכלוב הביתי שלו. העריכו את תנועת הגפיים העליונות של העכברים במהלך הפגישה בת שלוש הדקות. חשב את מספר מגעי הקיר שנוצרו על ידי הגפה הקדמית הפגומה ביחס לסך המגעים שנוצרו על ידי שתי הגפיים הקדמיות. יש לתת מי מלח או תחמוצת Clozapine N במינון של 1.2 מיליגרם לק"ג באמצעות הזרקה תוך-צפקית. בצע שוב את בדיקת הצילינדר כדי להעריך אפנון התנהגותי במודל העכבר של מחלת פרקינסון לאחר מתן קלוזפין N-oxide. לאחר חילוץ המוח מהחיה המורדמת, והנח אותו מיד בנוזל מוחי מלאכותי על בסיס סוכרוז קר כקרח כדי לשמור על שלמות התא בעזרת ויברטום, פורסים את המוח למקטעים בעובי של 300 עד 400 מיקרומטר. התאם את הגדרות כניסת הגז כדי לאזן עם 95% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני ב-34 מעלות צלזיוס. העבירו את פרוסות המוח לחדר מלא בנוזל מוחי מלאכותי. טען פיפטות זכוכית בתמיסה תוך-תאית קרה, מה שמבטיח התנגדות אלקטרודה בין שבעה ל-10 מגה-הם. הרכיבו פרוסות בתא הקלטה שקוע בטמפרטורה של שני מיליליטר לדקה עם נוזל מוחי מלאכותי מחומצן ב-34 מעלות צלזיוס. מקם פיפטות באמצעות מיקרומניפולטורים ממונעים תחת מיקרוסקופ ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות אינפרא אדום. קבע תצורת תא שלם באמצעות יניקה עדינה כדי לתקן נוירונים עם התנגדות של יותר מג'יגה-אוהם אחד. מהדקים את התאים במינוס 70 מילי-וולט באמצעות מגבר מהדק תיקון ורכשו זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים ספונטניים בסיסיים למשך שמונה דקות בקצב דגימה של 10 קילו-הרץ. הוסף 50 תחמוצת N קלוזפין מיקרו-מולרית לתא ההקלטה מיד לאחר המדידה הבסיסית. המשך להקליט נתונים למשך 16 דקות ועקוב אחר שינויים בתדירות או במשרעת זרם פוסט-סינפטי מעורר ספונטני. לבסוף, בצע הליך שטיפה על ידי החלפת תמיסת תחמוצת ה-N של קלוזפין בנוזל מוחי מלאכותי טרי והמשך בהקלטה כדי להעריך את ההתאוששות בפעילות הסינפטית. אפנון המוגני באמצעות תחמוצת N-clozapine הפחית את תנועת הגפיים הקדמיות הנגדיות בעכברים מושתלים ב-hM4Di והגדיל אותה בעכברים מושתלים ב-hM3Dq בהשוואה לטיפול במי מלח, מה שמדגים שליטה התנהגותית דו-כיוונית. רישומים אלקטרופיזיולוגיים גילו כי לתאים שהושתלו ב-hM4Di היו מרווחים ארוכים יותר ומשרעות שיא קטנות יותר בזרמים פוסט-סינפטיים מעוררים ספונטניים, בעוד שלתאים מושתלים hM3Dq היו מרווחים קצרים יותר ואמפליטודות גדולות יותר, מה שמעיד על דיכוי ושיפור בהתאמה של הפעילות הסינפטית. ניתוח אימונופלואורסצנטי אישר את הביטוי in vivo של טירוזין הידרוקסילאז ו-ZsGreen בתאי hM4Di ו-hM3Dq המושתלים, ותמך באינטגרציה מוצלחת של השתל.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מפרט פרוטוקול להנדסת תאי גזע שעברו תכנות מחדש באופן כימי לתאי קדמונים דופמינרגיים, לשימוש באפשרויות טיפוליות במחלת פריקינסון. באמצעות מודלים של עכברים, מחקר זה בוחן את ההשפעה ההתנהגותית ואת התכונות האלקטרופיזיולוגיות של התאים המושתלים, כדי להעריך את תפקודיותם ואת השילוב שלהם בסביבה העצבית של המארח.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- טיפול בתאי גזע
- מחלות נוירודגנרטיביות
רקע
- המחקר בוחן את תפקידן של תאי גזע מהונדסים גנטית בוויסות פעילות נוירונלית.
- המיקוד הוא במחלת פרקינסון, ובמיוחד בשילוב של תאים טיפוליים בתוך מעגלים עצביים פגועים.
- גישות נוכחיות המשתמשות בעריכה גנטית (למשל, CRISPR) שואפות להגביר את היעילות של טיפולים מבוססי תאים.
- הבנת מנגנונים אלו חיונית לקידום שיטות טיפול במחלות נוירודגנרטיביות.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול להשתלה של תאי גזע שעברו תכנות כימי במודלים של מחלת פרקינסון.
- הערכת היעילות התפקודית של תאים אלו בשיקום הפעילות הנורונלית.
- שימוש בטכניקות ניטור מתקדמות להערכת תוצאות התנהגותיות ואלקטרופיזיולוגיות כאחד.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפלטפורמה המרכזית כוללת השתלה של תאי גזע שעברו מודיפיקציה במודלים של עכברים.
- מודלים של עכברים עם מחלת פרקינסון משמשים באופן ספציפי להערכת הפוטנציאל הטיפולי של תאי קדם דופמינרגיים.
- מתודולוגיות מרכזיות כוללות את CRISPR לצורך מודיפיקציה גנטית והקלטות אלקטרופיזיולוגיות לניטור פעילות עצבית.
- בדיקות התנהגותיות, כגון מבחן הגליל (cylinder test), מועסקות להערכת השהיית התאוששות התפקוד המוטורי לאורך זמן.
- שלבים קריטיים כוללים אלקטרופורציה להחדרת חומר גנטי, והערכות פוסט-כירוגיות שונות של אינטגרציה תפקודית.
תוצאות עיקריות
- הודגש שילוב מוצלח של תאי גזע מושתלים במערכת העצבים של המארח, אשר הוביל להחלמה תפקודית.
- ניטור אלקטרופיזיולוגי חושף שינויים משמעותיים בפעילות העצבית בעקבות השתלת התאים.
- בדיקות התנהגותיות מעידות על שיפור בתפקודי המוטוריקה בעכברים שטופלו לאורך ציר הזמן הניסויי, דבר המצביע על מודולציה עצבית יעילה.
- תיקופים מרכזיים של הפרוטוקול מאשרים את מהימנות הגישה המבוססת על תאי גזע לטיפול בהפרעות נוירודגנרטיביות.
מסקנות
- מחקר זה מדגים נתיב מבטיח לפיתוח טיפולים תאיים המכוונים למחלות נוירודגנרטיביות.
- הממצאים מדגישים את הפוטנציאל לשליטה מדויקת בפעילות נוירונלית באמצעות תאי גזע מהונדסים.
- המחקר תורם משמעותית להבנת המנגנונים העומדים מאחורי מודולציה נוירונלית והחלמה במודלים של מחלות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בקרה כימו-גנטית מדויקת של תאי קדם דופמינרגיים המופקים מתאי גזע שעברו תכווט מחדש מאפשרת חקירה מבוקרת של השתלבות ותפקוד עצבי במודלים של מחלות נוירודגנרטיביות. גישה זו נותנת מענה לאתגר קריטי בשלב הגילוי: ביסוס ביטחון ניבוי בטיפולים מבוססי תאים על ידי קישור פעילות של תאים מהונדסים לתוצאות התנהגותיות ואלקטרופיזיולוגיות מדידות. השיטה תומכת בקידום מותאם-סיכונים של אסטרטגיות רגנרטיביות למחלת פרקינסון ולהפרעות קשורות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר תיקוף תפקודי של תאי קדם-נוירונליים מהונדסים במערכות הרלוונטיות למחלה.
- תומך בהפחתת סיכונים מנגנונית על ידי קישור של מודולציה כימוגנטית לתפוקות התנהגותיות וסינפטיות.
- מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי אספקת ראיות כמותיות לשילוב ולפעילות של הש transplanted.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מקיים בדיקות התנהגותיות ואלקטרופיזיולוגיות הניתנות לשחזור להערכת מועמדים לטיפול תאי.
- מנרמל מדדים כמותיים לתפקוד מוטורי ופעילות סינפטית במודלים פרה-קליניים.
- מכין מערכות מתוקפות עבור תהליכי סינון (screening) של תרכובות או תאים בשלבים הבאים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה פלטים פונקציונליים עם נקודות סוף התנהגותיות הרלוונטיות למחלה במודלים של מחלת פרקינסון.
- מאפשר רצף משלב ההנדסה של שלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של אינטגרציה ומודולציה של תאים.
- תומך בקבלת החלטות מותאמות סיכון לקידום מועמדים לטיפול תאי לעבר מחקרים תרגומיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
תהליכון עבודה זה של מודולציה כימוגנטית מגשר בין שלבי הגילוי המוקדמים, תיקוף מטרות והערכה פרה-קלינית בנתיבי מחקר של נוירוסיינס רגנרטיבי.
- ביולוגיה של גילוי: מספקת פלטפורמה לבדיקת היפותזות על אינטגרציה נוירונלית ותרומה פונקציונלית של תאים מהונדסים.
- סריקה: מספקת בדיקות התנהגותיות ואלקטרופיזיולוגיות סטנדרטיות וניתנות לשחזור להערכת מועמדים.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות כמותיות של פעילות סינפטית והתנהגות מוטורית לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין תפקוד תאים מהונדסים לנקודות קצה רלוונטיות למחלה, ובכך תומך בהתאמה של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר להערכה כימוגנטית והתנהגותית עבור מודלים שונים של ניו haciendo-דגנרציה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי באינטגרציה ובתפקוד של טיפולים תאיים.
- ערך תפעולי: מאפשר הערכה סטנדרטית, ניתנת להרחבה וניתנת לשחזור של מועמדים לתאים מהונדסים.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות המשך (go/no-go) ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתיקי פיתוח של רפואה רגנרטיבית.
- השפעה על תיק הפיתוח: תומך בתעדוף מותאם סיכון של נכסי טיפולים תאיים עבור התוויות נוירודגנרטיביות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהנדסת CRISPR, התמיינות של תאי גזע ומודולציה כימוגנטית.
- נדרש גישה לפלטפורמות אלקטרופיזיולוגיה, תשתית למערכי בדיקה התנהגותיים ודימות מתקדם.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של מדדי קריאה התנהגותיים וסינפטיים לצורך השוואה.
- התאמה למודלים שונים של מחלות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור סוג התא וסביבת המארח.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בתיקוף קפדני של אינטגרציה פונקציונלית ובטיחות במודלים תרגומיים.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:43
Construction of Non-Fusion Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs (DREADD) Stem Cell-Based Cell Lines
4:33
Transplanting DREADD Stem Cell-Derived Precursor Cells into Parkinson's Disease (PD) Model Mice
6:29
In Vivo Electrophysiological Profiling of Chemogenetically Modulated Cells
8:36
Results
