מכלול ביו-ריאקטור לתרבית מתמשכת של קהילות צואה מורכבות
25 באפריל 2025
פרוטוקול זה מפרט את הרכבת מערכי מיני-ביו-ריאקטור שישמשו לתרבית זרימה רציפה של קהילות צואה מורכבות בתנאים אנאירוביים. אנו דנים גם בשיטות ההרכבה, החיסון והדגימה של הכורים להמשך ניתוח.
אנו חוקרים אינטראקציות בין חיידקים מארחים וכיצד גורמים פנימיים וחיצוניים משפיעים על הבריאות, תוך התמקדות בהשפעות חיידקים על התפתחות סרטן, התקדמותו ותגובה לטיפול. חקרנו מעכבי מחסום חיסוני נגד PD-1 בקהילות חיידקים, ומצאנו שמטבוליטים חיידקיים משפרים את יעילות הטיפול נגד PD-1.
בידוד ההשפעה של גורמי המארח על המיקרוביום in vivo הוא מאתגר בשל השפעות מרובות. מערך המיקרוביו-ריאקטור מאפשר בחינה מבוקרת של תהליכים ספציפיים, תוך הבהרת השפעתם הישירה על קהילות מיקרוביאליות. פרוטוקול זה מציע שיטה חסכונית לטיפוח קהילות צואה בתנאים מבוקרים תוך שהוא מאפשר לחוקרים לבצע ניסויים במקביל במהירות יחסית.
[מדריך] כדי להתחיל, השג מערך כורים בעל שש בארות שהודפס בתלת מימד. חותכים שתים עשרה רצועות בגודל 25 מילימטר מצינורות PTFE בגודל 1/8 אינץ' והשתמשו בסכין גילוח כדי לגלח את הקצוות. הכנס קצה אחד של כל רצועה לתוך פתח הברגה של לואר זכר עם התאמה של 25 עד 28 חוטים. הברג היטב את האביזרים לתוך פתחי הפסולת והדגימה המיועדים של המערך. כעת, הכניסו מוט מיקרו-ערבוב לכל כור היטב. הברג חוט זכר 1/4-28 המתאים לחורי המקור של כל כור היטב. הברג אביזרי מתאם מוט צינור Luer נקבה לאביזרי ההברגה לחיבורי הפסולת והמקור של כל כור היטב. לאחר מכן הברג אביזרי מתאם דוקרני צינור נקבה Luer X ל-3-32/2 אינץ' לתוך אביזרי ההברגה 1/4-28 עבור יציאות המדגם. הניחו מחיצת גומי מעל מתאמי הדוקרנים של הצינור וקפלו את החלק העליון. לאחר מכן, חתוך שני סטים של צינורות E-LFL 2.06 מילימטר עבור קווי הפסולת והמקור. השתמש במים חמים כדי לרכך את הצינור לחיבור קל יותר. חבר את הצינור לנקבה Luer X לאביזרי מתאם דוקרני צינור בגודל 1/8 אינץ' עבור חיבורי המקור והפסולת. כעת תקן לואר זכר עם טבעת נעילה X עד 1/8 אינץ' מתאם דוקרני צינור המתאים לקצה השני של הצינור. הברג לתוכו מתאם דוקרני צינור Luer X נקבה ל-1/16 אינץ'. חבר את הצינורות הדו-עצירות בגודל המתאים לחיבורי המקור והפסולת המתאימים. לאחר מכן תקן נקבה נוספת של Luer X למתאם דוקרני צינור בגודל 1/16 אינץ' המתאים לקצה השני של הצינור. לאחר חזרה על כך עבור כל אביזרי המקור והפסולת, הכנס לואר זכר עם טבעת נעילה X עד 1/8 אינץ' אביזרי מתאם דוקרני צינור לחתיכת צינור E-LFL 2. חבר קצה אחד למתאם דוקרני הצינור הנקבה הלא תפוסה Luer X ל-1/16 אינץ' בקצה כל קטע צינורות דו-עצירות עבור כל החלקים. לאחר חזרה על זה עבור כל אביזרי המקור והפסולת, חבר את צינור ה-E-LFL 2.06 מילימטר לקווי המקור של בארות הכור 1 ו-2, באמצעות קצוות מנוגדים של נקבת Luer T. לאחר מכן תקן חתיכת צינור של חמישה סנטימטרים עם לואר זכר עם טבעת נעילה X עד אביזרי מתאם בגודל 1/8 אינץ' בכל קצה לשקע האמצעי של ה-T, מה שמוביל לצומת T שני. כעת חבר את צינור המקור E-LFL 2.06 מילימטר עבור הכור השלישי לצד הנגדי של ה-T השני. לאחר מכן, חבר לואר זכר עם טבעת נעילה X למתאם דוקרני צינור בגודל 1/8 אינץ' המתאים לקצה אחד של חתיכה של 25 סנטימטר של צינור E-LFL 2.06 מילימטר. תקן מתאם דוקרני צינור Luer X נקבה ל-1/8 אינץ' המתאים לקצה השני וכסה אותו בנייר אלומיניום. כדי להרכיב את בקבוק איסוף הפסולת, אבטח באופן רופף מכסה בעל שני חורים על בקבוק של שני ליטר. הכנס אביזרי חוט זכר 1/4-28 לשני החורים של הכובע. לאחר מכן חבר לואר נקבה עם מתאם דוקרני צינור בגודל 1/8 אינץ' להתאמת החוט הגברי שאינו מתחבר לצינור ה-PTFE המחובר מראש במכסה. חבר חתיכה של חמישה סנטימטרים של צינור E-LFL 2.06 מילימטר למתאם דוקרני הצינור שעל הבקבוק. חבר לואר זכר עם טבעת נעילה X למתאם דוקרני צינור בגודל 1/8 אינץ' לקצה השני של הצינור לפני כיסויו בנייר כסף. לבסוף, כסו את כל פקק הבקבוק בנייר אלומיניום לפני החיטוי ב-121 מעלות צלזיוס ו-15 psi למשך 45 דקות. לאחר השלמת החיטוי, הדק את האביזרים ואת אטמי נייר הכסף והנח את הכורים בתא אנאירובי למשך 48 שעות לפני השימוש. יישר את מערך הכור בתוך התא האנאירובי מעל לוח ערבוב מגנטי המוגדר ל-1,600 סל"ד. לאחר מכן הכנס את הצינורות הדו-עצירות הן עבור קווי המקור והן עבור קווי הפסולת לתוך המהדקים במשאבות הפריסטלטיות המתאימות. נעל את clamps במקומם אם הדבר נעשה פחות מ-25 שעות לפני השימוש. אחרת, השאר אותו רופף כדי להפחית את הבלאי של הצינור. כעת הסר את מכסה נייר הכסף מבקבוק המקור. הברג את אביזרי ה-Luer הזכר לאביזרי הברגה של 1/4-28, וודא שפתחים אלה מחוברים לצינור ה-PTFE הפנימי. הסר את מכסי נייר הכסף והצמד מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר לקו האוורור של חמישה סנטימטרים הן של בקבוק המקור והן של בקבוק הפסולת. התחל את הזרימה בקצב מתון כדי להתחיל למלא את הכור. ודא שצינור קו המותניים בתוך כל באר כור ממוקם נמוך יותר מצינור המקור כדי למנוע מילוי יתר או ריקון מוחלט של כל באר. כאשר הכורים מתחילים להתמלא, בדוק שכל הבארות מגיעות לאותו נפח ושהמדיה זורמת לקו המותניים לפני שתשאיר את הכורים לירוק בן לילה. התחל בהעברת חומרי הניסוי לתא האנאירובי למשך 24 שעות. לאחר חישוב כמות חיסון הצואה הדרושה, העבירו את דגימות הצואה השמורות בבקבוקונים קריוגניים לתוך החדר האנאירובי ואפשרו להן להפשיר למשך 15 דקות. עם קצה פיפטה רחב, העבירו את החומר הצואתי מבקבוקונים קריוגניים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור האטום ב-200 גרם למשך חמש דקות כדי ליישב חלקיקים. העבירו את הצינורות בחזרה לתא האנאירובי. ואז הסר את הסופרנטנט. השתמש במרית מעבדה לחיטוי כדי להעביר את 5.7 גרם המוצקים הצואתיים לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר. הוסף 17.1 מיליליטר של מי מלח סטריליים אנאירוביים לצינור ואטום היטב. כעת מערבב את הצינור במשך חמש דקות לפני הצנטריפוגה כפי שהודגם קודם לכן. השתמש במגבון מעבדה של 10% אקונומיקה כדי לעקר את המחיצה על גבי כל כור למשך שתי דקות לפחות. לאחר החזרת הדגימות לתא האנאירובי, יש להוציא את הסופרנטנט לצינורות חרוטיים חדשים של 50 מיליליטר. כעת העבירו 3.8 מיליליטר של נוזל צואה לשישה מזרקים נפרדים של חמישה מיליליטר המצוידים במחטים בגודל 16 בגודל 1.5 אינץ'. הסר את מגבון האקונומיקה ממחיצת הכור. לאחר מכן הכניסו את המחט דרך המחיצה והזריקו לאט 3.8 מיליליטר של תמיסת צואה לכל כור לפני שתשאירו את הכורים לשבת למשך הלילה. לאחר דגירה של 16 עד 18 שעות, התחל את הזרימה לכור. הגדר את צלחת הערבוב המגנטית למהירות מקסימלית מיד לאחר הזרקת תרחיץ הצואה. הרכב הקהילה המיקרוביאלית בשני הכורים המשכפלים השתנה עם הזמן כאשר מינים שונים הראו שפע יחסי משתנה לאורך ימים. חיידקים אנאירוביים קפדניים, כגון סוגים של קלוסטרידיום, זוהו באופן עקבי בכל כור בכל נקודות הזמן.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט את הרכבתם של מערכי מיני-ביוריאקטורים לתרבית בזרימה רציפה של קהילות צואה מורכבות תחת תנאים אנאירוביים. הוא מאפשר בחינה מבוקרת של תהליכים ספציפיים המשפיעים על קהילות מיקרוביאליות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- ביוטכנולוגיה
- אימונולוגיה
רקע
- אינטראקציות בין חיידקים למארח הן חיוניות להבנת הבריאות.
- להשפעות של חיידקים על התפתחות הסרטן ותגובה לטיפול יש משמעות רבה.
- בידוד השפעתם של גורמי המארח על המיקרוביום הוא מאתגר.
- מערכים של מיני-ביוריאקטורים מקלים על ביצוע מחקרים מבוקרים של קהילת חיידקים צוארית.
מטרת המחקר
- לגידול קהילות צואה בתנאים מבוקרים.
- לאפשר ניסויים מקבילים לקבלת תוצאות מהירות.
- להבהיר את ההשפעות של תהליכים ספציפיים על קהילות מיקרוביאליות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרכבת מערכים של מיני-ביוראקטורים.
- החדרה של קהילות צואה מורכבות למגיבים.
- דגימה לצורך ניתוח המשכי.
- תרבית בזרימה רציפה תחת תנאים אנאירוביים.
תוצאות עיקריות
- מטבוליטים בקטריאליים משפרים את יעילות הטיפול ב-anti-PD-1.
- מערך המיקרו-ביוריאקטור מאפשר בחינה מבוקרת של תהליכים מיקרוביאליים.
- שיטה חסכונית לגידול של קהילות צואה.
- מקל על ביצוע ניסויים מקביליים מהירים.
מסקנות
- מערך המיני-ביוריאקטור הוא כלי בעל ערך למחקר של המיקרוביום.
- הבנת אינטראקציות חיידקיות יכולה לסייע בגיבוש אסטרטגיות לטיפול בסרטן.
- תנאים מבוקרים משפרים את מהימנותם של תוצאות הניסוי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
גידול מבוקר של קהילות צואה מורכבות במערכי מיני-ביוראקטורים מאפשר בחינה מדויקת של מנגנונים המונעים על ידי המיקרוביום הרלוונטיים למחלה ולתגובה טיפולית. מערכת זו תומכת במחקרים מבוססי היפותזה על ידי בידוד משתנים סביבתיים והפרדה של גורמי מאכסן, ובכך מגבירה את הביטחון החזוי במחקר מיקרוביום. גישה זו ממוקמת באופן אסטרטגי לצורך גילוי מוקדם והפחתת סיכונים מנגנוניים בשרשראות פיתוח ביו-פרמצבטיות המתמקדות באינטראקציות מאכסן-מיקרובים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של תגובות קהילה מיקרוביאלית לחשיפות סביבתיות מוגדרות.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטית על ידי בידוד השפעות חיידקיות מגורמים מבלבלים שמקורם במארח.
- מקל על תיקוף פונקציונלי של קונסורציומים מיקרוביאליים או של זנים בודדים תחת תנאים מבוקרים.
- משפר את הביטחון החזוי עבור היפותזות טיפוליות המכוונות למיקרוביום.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות מיקרוביאליות מתוקפות וניתנות לשחזור עבור תהליכי סריקה המשכיים.
- מקיים סטנדרטיזציה של תנאי הבדיקה למדידה כמותית של הרכב הקהילה והפלט המטבולי.
- מאפשר ניסויים במקביל להאצת הערכה של משתנים או תרכובים מרובים.
- תומך ביכולת הרחבה (scalability) ובשימוש חוזר בפלטפורמה עבור מחקרי מיקרוביום מגוונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים של קהילות מיקרוביאליות in vitro לחשיפות ולהתערבויות הרלוונטיות למחלה.
- מספקת המשכיות מממצאי שלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של אסטרטגיות לוויסות המיקרוביום.
- מאפשרת קידום של קונספטים טיפוליים מבוססי מיקרוביום תוך התאמה לרמת הסיכון.
- תומכת בזיהוי של סמנים ביולוגיים תרגומיים הקשורים לפעילות מטבולית מיקרוביאלית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
מערכת מיני-ביוריאקטור זו משתלבת ברצף השלב של השלב של הגילוי ועד לשלב הפרה-קליני, בכך שהיא מאפשרת מחקרים מבוקרים ומונחי-השערה של דינמיקה ותפקוד של מיקרוביום.
- ביולוגיה גילויית: תומך בבדיקת השערת האפס ובבירור מסלולים באמצעות בידוד משתנים סביבתיים או פרמקולוגיים ספציפיים.
- סריקה: מספק פלט כמותי הניתן לשחזור עבור הרכב הקהילה המיקרוביאלית ומדידות מטבוליות.
- אנליטיקה: מאפשר השוואה סטטיסטית של תנאי ניסוי וניתוחים של מהלכי זמן.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאים in vitro למודלים in vivo או למודלים פרה-קליניים על ידי אפשור מחקרי הפרעה מבוקרים.
- שימוש חוזר ארגוני: מספק פלטפורמה מודולרית וסתגלנית למחקר מיקרוביום מתמשך בתחומי טיפול שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים המכוונים למיקרוביום.
- ערך תפעולי: מתקנן את תהליכי הגידול והדגימה לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ומיון יעיל של פורטפוליו בתוכניות מיקרוביום.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום של מועמדים לטיפולים מבוססי מיקרוביום.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוביולוגיה אנאירובית ובהרכבת ביו-ריאקטורים.
- מחייב גישה למכשור ייעודי, כולל תאי אנאירוביים ומשאבות פריסטלטיות.
- מצריך סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים של פרוטוקולי מדיה, הזרקה ודגימה.
- ניתן להתאמה למערכות מודל ולמבני ניסוי שונים באמצעות שינויים בפרוטוקול.
- מוגבל על ידי הצורך לשמור על תנאים אנאירוביים ואספטיים קפדניים לאורך כל תהליכי העבודה.
שאלות נפוצות בנושאי ביו-פארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:03
Assembly and Sterilization of a 6-Well Reactor Array for Anaerobic Fecal Microbiota Culture
5:40
Setup and Initialization of the Reactor Array in an Anaerobic Chamber
7:03
Preparation and Inoculation of Fecal Microbiota in Anaerobic Reactors
9:10
Results
