גישה יעילה לפרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה תוך שימוש באזורי רקמה נבחרים

פיתחנו שיטה יעילה לחקר הפרוטאום באזורים ספציפיים של דגימות רקמה גבוהות יותר באמצעות ספקטרומטריית מסה. מטרתנו היא לשפר את הטכניקה הפרוטאומית, כולל הכנת דגימות וניתוח ספקטרומטריית מסה, כדי להשיג דיוק ואמינות גבוהים. אתגר אחד בפרוטאומיקה מרחבית מבוססת FFPE הוא עיכול חלבון לא שלם, מה שמפחית את כיסוי החלבון הכולל.

התגברות על אלה דורשת פרוטוקולי עיכול אופטימליים ואסטרטגיות ספקטרומטריית מסה משופרות כדי לשפר את עומק הפרוטאום והדיוק. זיהינו שינויים מובהקים בחלבון על פני סוגים שונים של מחלת לבלב, וסיפקנו תובנה לגבי ההבדלים בין מצבים שפירים וטרום סרטניים. ממצאים אלה יכולים לסייע באבחון מוקדם של סרטן הלבלב.

אנו שואפים לקדם את שיטת הפרוטאינאז של המטופל כדי להשיג מיפוי חלבונים ברזולוציה גבוהה בתוך אזורי רקמה. תוך שימוש בפרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה, אנו מבקשים לזהות חתימות מולקולריות ספציפיות לאזור התורמות לגילוי סמנים ביולוגיים. הגישה שלנו משלבת את מלכודות המטופלים וההכנה המוקדמת עם ספקטרומטריית מסה בלתי תלויה בנתונים כדי לייצר במהירות נתוני פרוטאום באיכות גבוהה מאזורי רקמת FFPE נבחרים.

שיטה זו מאפשרת כימות גדול של הפרוטאום המרחבי. כדי להתחיל, הכינו שקופית רקמה מוכתמת בהמטוקסילין ואאוזין או מוכתמת באימונוהיסטוכימיה עם אזור העניין שצוין על ידי פתולוג. הנח את שקופית הרקמה הלא מוכתמת ואת הרקמה המוכתמת מחליקה גב אל גב, תוך הקפדה על יישור נכון.

בעזרת אזמל מסירים אזורי רקמה שאינם מעניינים ומגרדים את אזורי הרקמה המעניינים לכיוון מרכז השקופית. העבירו את הרקמה שנאספה לצינור קשירת חלבון דל חלבון נקי של 1.5 מיליליטר והוסיפו 180 מיקרוליטר של מאגר ליזה SDS לכל צינור. בצע סוניקציה של בדיקה במשרעת של 20% למשך 10 מחזורים של חמש שניות הפעלה וחמש שניות כיבוי.

כעת, דגרו את הדגימות ב-100 מעלות צלזיוס למשך 3.5 שעות תוך שמירה על מהירות של 1,000 גרם.לאחר הדגירה, הניחו לדגימה להתקרר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה ב-16,000 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי להפריד פסולת רקמות מהסופרנטנט. יש לאסוף את הסופרנטנט לתוך שפופרת נקייה עם תווית ולאחסן בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

עבור משקעי אצטון, הנח את דגימת החלבון המתאימה ל-100 עד 300 מיקרוגרם לתוך צינור תואם אצטון. לאחר מכן, הוסיפו אצטון קר כקרח, מקורר מראש למינוס 20 מעלות צלזיוס, בנפח פי חמישה מנפח הדגימה. דוגרים על התערובת במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות.

לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הצינור ב -16, 000 גרם למשך 15 דקות. השלך בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור החלבון. הוסף 500 מיקרוליטר אצטון ממוזג במינוס 20 מעלות צלזיוס וצנטריפוגה.

לאחר סילוק הסופרנטנט, יבש את הדגימה באוויר. הכן את מאגר הליזיס לכידת המתלים במים נטולי יונים. לאחר מכן, הוסף 40 מיקרוליטר של המאגר המוכן לצינור הדגימה ומערבולת היטב כדי להמיס את גלולת החלבון המיובשת באוויר.

מניחים את הדגימה באינקובטור רועד בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס בטמפרטורה של 1,000 גרם למשך 35 דקות. לאחר מכן, הוסף לדגימה 10 מיקרוליטר של מגיב האלקילציה ודגר את הדגימה בטמפרטורת החדר ב -300 גרם למשך שעה. בתוך מכסה אדים כימי, הוסף לדגימה חמישה מיקרוליטר של חומצה טריכלורואצטית של 10%, מה שהופך את הנפח הכולל ל-55 מיקרוליטר.

בדוק את ה-pH של הדגימה באמצעות נייר pH כדי לוודא שהוא פחות מאחד. לאחר מכן, הוסף 350 מיקרוליטר של מאגר קשירה אחד לדגימה כדי ללכוד חלבונים. הנח את עמוד לכידת המתלים לתוך צינור של שני מיליליטר והעביר את כל הדגימה, כולל כל חומר בלתי מסיס, לתוך העמודה.

צנטריפוגה של העמודה ב -4, 000 גרם למשך 50 שניות כדי ללכוד חלבונים. לאחר מכן, הוסף 400 מיקרוליטר של מאגר כביסה שתיים. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הזרימה.

לאחר הכביסה הסופית, צנטריפוגה את העמוד ב-4,000 גרם למשך 1.25 דקות כדי להבטיח מעבר מלא של המאגר הראשון. הוסף 125 מיקרוליטר של מאגר עיכול לעמוד לכידת המתלים וכסה אותו כדי למנוע אידוי. דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות ללא טלטול.

כעת, הוסף 80 מיקרוליטר של מאגר פליטה אחד לעמודת לכידת המתלים והצנטריפוגה ב-4,000 גרם למשך 1.25 דקות. משוך את הפפטידים המופשטים והעביר אותם לצינור חדש ונקי. לאחר כימות פפטידים, ליופיליזציה של 20 מיקרוגרם פפטידים.

ממיסים מחדש את הפפטידים הליופיליים ב-40 מיקרוליטר של מאגר מימי המכיל 3% אצטוניטריל במי חומצה פורמית 0.1% וסוניקט למשך 10 דקות באמבט סוניקציה. צנטריפוגה של הדגימה ב-16,000 גרם למשך 60 דקות והעבירה את הסופרנטנט לבקבוקונים לניתוח ספקטרומטריית מסה. הזרקו שני מיקרוליטר מכל דגימה באמצעות הדגימה האוטומטית של מערכת ספקטרומטריית המסה של כרומטוגרפיה ננו-נוזלית.

פפטידים נפרדים על עמודת פאזה הפוכה ארוזה בחומר C18 של שלושה מיקרומטר באמצעות שיפוע של 127 דקות של חמישה עד 35% אצטוניטריל ב-100 ננוליטר לדקה. יינון הפפטידים באמצעות מקור יונים ננו-ספריי והעברתם לספקטרומטר מסה מבוסס אורביטראפ. לנתח פפטידים בשיטת רכישה צרה-תלויה בנתונים.

בידוד אזור עניין מדויק במהלך עיבוד רקמות FFPE הושג על פני רקמות שונות המשובצות בפרפין ציסטי ציסטי קבוע בלבלב. כרומטוגרמות יונים כוללות הניתנות לשחזור התקבלו בין טרירפלזמות ביולוגיות עבור כל סוג של ניאופלזמה ציסטית בלבלב. ניתוח ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית זיהה 9,703 חלבונים.

השפע של כל החלבונים שזוהו השתרע על פני 6.25 סדרי גודל, מה שמדגים כיסוי מקיף של פרוטאום, וסמני חלבון סרטן הלבלב הידועים כומתו. זוהו בסך הכל 933 חלבונים המתבטאים באופן דיפרנציאלי, עם 457 מווסתים ו-476 מווסתים בניאופלזמות ריריות פפילריות תוך-צינוריות. ניתוח ביואינפורמטי גילה כי חלבונים המתבטאים באופן דיפרנציאלי היו קשורים למספר מסלולים הקשורים לסרטן הלבלב.