יצירה ואפיון של אסטרוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם וחסרים ריבונוקלאופרוטאין שליח X שביר

עבודה זו מתמקדת בארבעה אסטרוציטים אנושיים ספציפיים למוח וכיצד הם משתנים על ידי הפרעות נוירו-התפתחותיות כגון תסמונת ה-X השביר. עבודות קודמות השתמשו במודלים של בעלי חיים כדי לחקור בעיקר נוירונים, כך שעבודה זו מוסיפה ממד חדש לתחום מחקר זה.

תובנות מכניסטיות ממחקרים בבעלי חיים נתקלו בהצלחה קלינית מוגבלת. האתגר העיקרי הוא להשיג תובנות דומות על נוירונים ואסטרוציטים ממקור אנושי.

הפרוטוקול שלנו יצר בהצלחה אסטרוציטים פונקציונליים לרוח, המציגים מטבוליזם לא מווסת, גליקוליטי ומיטוכונדריאלי בתסמונת ה-X השביר, מה שמאפשר חקירה של תפקידם של תאי גליה בביולוגיה של מחלות. למרות עדויות הולכות וגדלות על תפקיד המפתח של גליה בתפקוד עצבי בבריאות ובמחלות, מעט ידוע על האופן שבו אסטרוציטים אנושיים מושפעים בהפרעות נוירו-התפתחותיות, כגון תסמונת ה-X השביר.

במבט קדימה, נבנה על המסגרת הזו כדי לחקור כיצד אסטרוציטים והאינטראקציות שלהם עם תאי עצב משתנים על ידי מחלות, ואז כיצד ניתן לתקן אותם על ידי התערבויות טיפוליות.

[מדריך] כדי להתחיל, מצפים צלחת עם שש נפיחות במטריגל מדולל ביחס של 1 ל-60 ב-DMMF 12 מתקדם. אחסן את המנה המצופה בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס. ביום התרבות מוציאים את חומר הציפוי מהצלחת ומוסיפים מיליליטר אחד של מדיום שמונה חיוני שלם, יחד עם מעכב סלע בריכוז סופי של X אחד. מניחים את המנה בתוך אינקובטור. מוגדר על 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני לפני הוספת תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם, או IPSCs. זרע את ה-IPSCs האנושיים במדיום שמונה חיוני שלם עם מעכב הסלע בריכוז סופי של X אחד כדי לשפר את היצמדות המושבה. למחרת, החלף את כל שמונת המדיום החיוני במדיום טרי, חסר מעכב סלע. המשיכו לחדש את המדיום מדי יום עד שהתאים מגיעים למפגש של 80%, מה שנמשך כארבעה עד חמישה ימים. כאשר המושבות מגיעות למפגש של 80%, הוסיפו תערובת של קולגנאז ודיספו כדי לנתק אותן אנזימטית מהצלחת. לאחר שהמושבות מתחילות להתרומם, הוציאו את המנה מהחממה והוסיפו שני מיליליטר DPBS כדי לנטרל את פעילות האנזים. בעזרת DPBS, מגרדים את המושבות ואוספים את התרחיף לצינור חרוטי של 15 מיליליטר, באמצעות לוח רחב של פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר. לאחר מכן, בעזרת פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר, יש לשלש בעדינות את התרחיף פעמיים עד שלוש כדי לפרק את המושבות. אפשר למושבות להתיישב. לאחר כשתי דקות, שאפו את תערובת האנזים DPBS תוך השארת כמיליליטר נוזל בצינור. לאחר מכן הוסף שני מיליליטר DPBS לצינור וערבב על ידי הקשה עדינה כדי להשעות מחדש את המושבות. הניחו להם להתייצב, וחזרו על תהליך זה פעמיים כדי להסיר שאריות אנזים. לאחר הסרת הסופרנטנט, השעו מחדש את המושבות במיליליטר אחד של שמונה מדיום חיוני מלא וצלחת אותם לכלי מצופה מטריג'ל טרי. להרים אנזימטית את תאי הגזע הפלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם כפי שתואר קודם לכן. צלחת אותם על צלחת תרבית מתלה 100 מילימטר שאינה דבוקה עם מדיום מוגדר כימית. הנח את תרחיף התא על שייקר אורביטלי במהירות של 40 סיבובים לדקה למשך שבעה ימים בתנאים נורמוקסיים כדי להקל על התפתחות כדורי קורטיקו. ביום השמיני, העבירו את כדורי הקורטיקו למדיום שגשוג תאים ושמרו עליהם במשך שבעה ימים. כדי לגרום למפרט גליה, דגרו את כדורי הקורטיקו במדיום העשרת גליה למשך שבועיים כדי להשיג כדורי גליה מוקדמים. להבשלה של כדורי גליה מוקדמים, החלף את גורם הגדילה הפיברובלסטים הבסיסי H ב-20 ננוגרם למיליליטר של גורם מעכב לוקמיה, ושמור על הכדורים למשך ארבעה שבועות.

לאחר ארבעה שבועות במדיום התבגרות, המשיכו לשמור על הכדורים במדיום העשרת גליה לתקופות ממושכות. כדי למנוע צבירה ואובדן כדאיות, קוצצים מכנית את כדורי הגליה כל שבועיים, באמצעות להב תעשייתי סטרילי. החלף את כל המדיום ב-DNase אחד כדי להסיר שברי DNA שנוצרו מהקיצוץ. לאחר מכן נתק את כדורי הגליה לשכבות מונו של תאי אב אסטרוציטים, באמצעות ערכת דיסוציאציה של פפאין. צלחת את התאים המנותקים על תרבית תאים, צלחת דביקה מטופלת מצופה מראש במטריג'ל בדילול של 1 עד 80. להפיץ את תאי האב של האסטרוציטים במדיום העשרת גליה עד שהם מגיעים למפגש של 80%. המעבר התאים מסירים את המדיום המושקע ואוספים אותו בצינור חרוטי. הוסף מדיום ניתוק תאי אנזים לתאים והמתן דקה עד שתיים. לאחר שהתאים מתחילים להתנתק, הוסף את המדיום המושקע כדי לנטרל את פעילות האנזים. אוספים את תרחיף התאים והצנטריפוגה בטמפרטורה של 800 גרם למשך שתי דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, השעו מחדש את התאים במדיום העשרת גליה. צלחת בערך אחת כפול 10 בחזקת שישה תאים לבאר על צלחת מצופה מטריג'ל בדילול של 1 עד 80. לשימור בהקפאה, השעו מחדש את כדור התא בתערובת קרה של 90% מדיום התפשטות כדור קורטיקו ו-10% קריופרוטקנט. העבר את התאים התלויים מחדש לבקבוקוני קריו. העבירו מיד את בקבוקוני הקריו לקופסת קריו ושמרו במקפיא בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, העבירו את כל בקבוקוני הקריו למיכל חנקן נוזלי לאחסון לטווח הארוך. לאפיין את תאי האב האסטרוציטים המנותקים על ידי צביעה חיסונית עם סמני וימנטון וגורם גרעיני IAM. כדי לאשר את הספציפיות האזורית של ארבעת המוח של APCs אנושיים שמקורם ב-IPSC, בצע ניתוח QPCR בזמן אמת עבור תיבת ראש מזלג אנושית G1 ותיבת הומאו אנושית, B4. להבדיל APCs לאסטרוציטים ולמדיום התמיינות אסטרוציטי למשך 14 יום. צלחת אסטרוציטים על צלחת זכוכית של 35 מילימטר בצפיפות של חמישה כפול 10 בחזקת שלושה תאים לצלחת כדי למדוד את תגובתם לאדנוזין חמישה טרי פוספט. אפשר לתאים להיצמד לתחתית הזכוכית למשך 24 שעות. שטפו את התאים הדבוקים שלוש פעמים עם תמיסת המלח המאוזנת של האנק ללא סידן. לאחר מכן דגרו את התאים במדיום התרבית המכיל חמישה משתין מטרי ביחס מיקרומולרי 2:00 לפנות בוקר, ו-0.02% פלורוני F127 למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת התאים פעמיים במדיום תרבית, החלף את המדיום בשני מילי-מולרי סידן המכיל את תמיסת המלח המאוזן של האנק. דמיין את התאים בשתי פריימים לשנייה, באמצעות מטרת טבילת שמן פי 60 על סחיפה ממוקדת המפצה על מיקרוסקופ הפוך. לבסוף, רשום תגובות סידן המושרות על ידי ATP לאחר הוספת ATP בריכוז סופי של חמישה מילימולר בסימן 25 שניות. מושבות IPSC אנושיות ביטאו סמנים פלוריפוטנטיים בוחרים ארבע וננו כפי שאושר על ידי צביעה חיסונית. APCs שמקורם בתסמונת X שביר וקווי ביקורת הראו פרופורציות דומות של תאים חיוביים לוימנטין ו-NFIA. תאי אב אסטרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם מתסמונת ה-X השביר הראו ויסות מוגבר של Fox G1, בהשוואה ל-HOXB4, מה שמעיד על זהות קדמית במוח. אסטרוציטים שמקורם בקווי תסמונת ה-X השביר של IPSC אנושיים הראו מספר מופחת של ביטוי GFAP. אסטרוציטים של תסמונת X שביר וביקורת הראו מעברי סידן המושרים על ידי ATP, אך מספר המגיבים היה נמוך משמעותית באסטרוציטים של תסמונת X שביר. משרעת השיא של חולף הסידן הראשון שעורר ATP הייתה נמוכה משמעותית באסטרוציטים של תסמונת X שביר בהשוואה לתאי הביקורת. אסטרוציטים אנושיים של תסמונת X שביר שמקורם ב-IPSC הראו עלייה בגליקוליזה, ביכולת הגליקוליטית וברזרבות הגליקוליטיות, אך הראו ירידה משמעותית בנשימה המקסימלית בהשוואה לאסטרוציטים בבקרה.