Name: עריכת אפיגנום CRISPR בתאים אנושיים באמצעות טרנספקציה של DNA פלסמיד והעברת נוקלאופקציה של mRNA (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: למד עריכת אפיגנום CRISPR בתאים אנושיים באמצעות טרנספקציית DNA פלסמיד והעברת נוקלאופקציה של mRNA. שיטות אלו מאפשרות מודולציה מכוונת של ביטוי גנים ללא שבירות DNA רעילות ומפחיתות רעילות ואי-יציבות גנומית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

למרות שהתוכן הגנומי של כל תא בגופנו כמעט זהה, פרופיל השעתוק של כל סוג תא שונה מאוד. שינויים אפיגנטיים ב-DNA ובחלבוני היסטון הם מווסתים מרכזיים של ביטוי שעתוק. אוכרומטין פעיל שעתוק מסומן על ידי סימנים אפיגנטיים מובהקים בהשוואה להטרוכרומטין קומפקטי שאינו פעיל מבחינה שעתוק. לדוגמה, אזורים הטרוכרומטיים מוגדרים על ידי שינויים מדכאים בהיסטון, כולל טרימתילציה על ליזין 9 של היסטון 3 (H3K9me3), טרימתילציה על ליזין 27 של היסטון H3 (H3K27me3), ומתילציה של DNA על ציטוזינים ליד גואנינים (CpG) במקדמי גנים1. אזורים גנומיים של ביטוי גנים פעילים מוגדרים בדרך כלל על ידי אצטילציה של היסטון וטרימתילציה על ליזין 4 של היסטון 3 (H3K4me3)1.
מהפכת ה-Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) יצרה שפע של כלים המאפשרים שינוי מתוכנת של רצפים גנומיים. טכנולוגיית CRISPR מבוססת על מנגנון הגנה פרוקריוטי המסוגל לבקע חומצות גרעין ברצפי מטרה הניתנים לתכנות. נוקלאזות CRISPR 2,3,4, עורכי בסיס 5,6 ועורכים ראשיים 7,8 יכולים לשנות את רצף ה-DNA של גנומים של יונקים באמצעות חיתוך DNA ותיקון של שברים אלה. למרות יעילותן, אסטרטגיות אלה יכולות לגרום לשבירות DNA באתרים מחוץ למטרה 9,10 ולמוטציות מבניות גנומיות בקנה מידה גדול 11,12,13,14,15. כלים חלופיים מבוססי CRISPR מאפשרים אפנון ניתן למעקב של הפעלה ודיכוי גנים מבלי לשנות את רצף ה-DNA הבסיסי. כלים אלה רותמים Cas9 חסר נוקלאז (dCas9), המאפשר קשירת DNA באתרי יעד המוכתבים על ידי רצף sgRNA, בשילוב עם חלבוני אפקטור המשנים את נוף הכרומטין 16,17,18. חלבוני אפקטור, כגון כותבים אפיגנטיים, קוראים ומחקים, יכולים להתמזג ישירות ל-dCas9 או לגייס אותם על ידי פיגום פפטיד המותך ל-dCas9, כגון SunTag, או פיגום RNA על ה-sgRNA, כגון מערכת MS2-MCP 16,17,18. דוגמאות לכלי בקרת שעתוק הניתנים לתכנות כוללות הפעלת CRISPR (CRISPRa)19,20,21 והפרעות CRISPR (CRISPRi)22,23. CRISPRa מתפקד על ידי גיוס ישיר של מנגנון השעתוק, הגדלת ביטוי הגנים של שעתוק היעד19. לעומת זאת, CRISPRi מדכא שעתוק על ידי יצירת H3K9me3, סימן אפיגנטי מדכא22.
ההתקדמות בעריכת אפיגנום אפשרה שימוש נרחב בכלים אלה בתחומים מדעיים. היתוך של תחומי אפקטור וחלבונים שונים הרחיבו את ערכת הכלים של עורכי אפיגנום זמינים 18,24,25,26,27,28,29,30. בנוסף, עורכי אפיגנום משמשים לפענוח התפקידים של שינויים אפיגנטיים 31,32,33,34,35,36, אפקטורים 37,38,39 ומוטציות אפקטור 28,40,41 בוויסות גנים. באופן ספציפי, CRISPRi ו-CRISPRa משמשים במסכי גנומיקה פונקציונליים למגוון תהליכים ביולוגיים, כולל הישרדות תאים42 וגורל תא 43,44,45,46,47. יתר על כן, עריכת אפיגנום טומנת בחובה פוטנציאל טיפולי להנדסת תאים ex vivo וטיפולים in vivo 18.
כאן, אנו מתארים שיטות ליישום שני עורכי אפיגנום מבוססי dCas9 לדיכוי שעתוק הניתן לתכנות בשורות תאים אנושיים: CRISPRi22 ו-CRISPRoff48. CRISPRi הוא היתוך של dCas9 לתחום ה-KRAB המדכא מחלבון אצבע אבץ כגון ZNF10 (KOX1) ו-ZIM322,23. כאשר CRISPRi מכוון למקדם גן מסוים, תחום ה-KRAB מגייס כותב H3K9me3, SETDB1, כדי לדכא את גן המטרה (איור 1A). כאשר CRISPRi מתבטא באופן ארעי, ה-H3K9me3 המבוסס בלוקוס המטרה אינו נשמר, וביטוי הגנים משוחזר לאורך זמן32,48. כדי לבצע נוקדאונים יציבים באמצעות CRISPRi כמו ביישומי גנומיקה פונקציונליים, ביטוי מכונן של CRISPRi בתאים יחד עם ה-sgRNA הוא חיוני. לאחרונה, CRISPRoff תוכנן לתכנת עריכת אפיגנום תורשתית48. CRISPRoff הוא היתוך חלבון יחיד של dCas9 לתחום KRAB וקומפלקס דה נובו DNA methyltransferase, DNMT3A ו-DNMT3L. פולס חולף של CRISPRoff בתאים אנושיים מתכנת שקיעה של H3K9me3 ומתילציה של DNA בגנים הממוקדים, מה שמוביל לדיכוי ארוך טווח של גני מטרה על ידי שמירה על מתילציה של DNA ו-H3K9me3 (איור 1B)48. יתר על כן, ניתן לבטל עריכות אפיגנום. לדוגמה, גן שהושתק ביציבות על ידי CRISPRoff יכול להיות מופעל מחדש על ידי TET1-dCas9 שיכול להסיר אנזימטית את סימני המתילציה של ה-DNA במיקומי מטרה49.
פרוטוקול זה יפרט שתי שיטות אספקה לביטוי חולף של עורכי אפיגנום: טרנספקציה של DNA פלסמיד ונוקלאופקציה של mRNA. בנוסף, אנו מתארים כיצד להשתמש בזרימה ציטומטרית כדי להעריך את יעילות עריכת האפיגנום בשני גנים אנדוגניים, CLTA ו-CD55. ניתן להתאים שיטות אלה וליישם אותן בניסויי עריכת אפיגנום אחרים באמצעות עורכים נוספים או להשתמש בהן למיקוד גנים שונים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68089/68089fig01.jpg"> 
איור 1: סכמטי של מנגנון העריכה וזרימת העבודה של אפיגנום CRISPRi ו-CRISPRoff. (A) סכמות ליניאריות של הטרנסגן sgRNA ועורך האפיגנום CRISPRi. התוספת של CRISPRi ו-sgRNA מאפשרת להוסיף את סימן ההיסטון המדכא H3K9me3 כדי להשתיק את מיקום המטרה. רמת ההשתקה הגבוהה ביותר מושגת בשלב מוקדם לאחר הוספת CRISPRi, ומטרת הגן מופעלת מחדש בדרך כלל לאחר מספר מעברים. (B) סכמות ליניאריות של הטרנסגן sgRNA ועורך האפיגנום של CRISPRoff. התוספת של CRISPRoff לתאים המכוונים לגן מעניין מובילה לתוספת של H3K9me3 מדכא יחד עם מתילציה של DNA באתרי CpG כדי להשתיק את גן המטרה. השתקה על ידי CRISPRoff היא תורשתית - רמת ההשתקה הגבוהה מושגת בשלב מוקדם במהלך הטרנספקציה ונמשכת על פני חלוקות תאים מרובות. (C) סקירה כללית של ציר הזמן לעריכת אפיגנום בשיטת טרנספקציה. ביום 0, התאים מצופים לטרנספקציה. ביום הראשון, ניתן להכניס את העורך והמדריך פלסמיד לתאים באמצעות טרנספקציה. ביום השלישי, התאים יוערכו לביטוי BFP באמצעות ציטומטריית זרימה. אחוז ה-BFP משמש כגורם מנרמל לקביעת יעילות ההשתקה הסופית של הניסוי עבור כל מצב. ביום השישי ואילך, התאים מנותחים להשתקת המדווח המעניין מכיוון שרמת ההשתקה הגבוהה ביותר תושג ביום זה. (D) סקירה כללית של שיטת טרנספקציה שבה עורך אפיגנום ופלסמידים sgRNA מתווספים לתאים בצורה טיפתית. (E) סקירה כללית של ציר הזמן לעריכת אפיגנום באמצעות שיטות נוקלאופקציה. בפרוטוקול זה, mRNA הוא נוקלאופקציה לתאים ביום 0. התאים מוערכים להשתקה ביום השלישי לאחר נוקלאופקציה באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה. (F) סקירה כללית של פרוטוקול הנוקלאופקציה. כמויות מתאימות של תאים ו-mRNA מעורבבות ומתווספות לקובטות נוקלאופקטור. אם ה-sgRNA מוכנס על ידי נוקלאופקציה, ניתן להוסיף אותו גם לתערובת זו. הקובטות מוכנסות לתוך הגרעין וקודי דופק מתאימים משמשים להחדרת ה-mRNA לתאים. לאחר נוקלאופקציה, התאים מצופים ומועברים לניתוח בימים מאוחרים יותר. (G) השוואה בין טרנספקציה של פלסמיד לאסטרטגיות נוקלאופקציה של mRNA לעריכת אפיגנום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68089/68089fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>AAF-1003</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות צלחות תרבית רקמות</td><td>קורנינג</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות U-bottom צלחת</td><td>קורנינג</td><td>351177</td><td></td></tr><tr><td>APC אנטי אנושי CD55 נוגדן</td><td>BioLegend</td><td>311312</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSymphony A1 זרימה ציטומטר</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אקונומיקה</td><td>שעווה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>11003428432 צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5425</td><td></td></tr><tr><td>רוזנת מונה תאים אוטומטי</td><td>תרמו מדעי</td><td>רוזנת 3</td><td></td></tr><tr><td>CRISPRoff transfection פלסמיד</td><td>Addgene&nbsp;</td><td></td><td></td>167981</tr><tr><td>מגיב המטולוגיה מדלל 2 לזרימה ציטומטרית (נוזל נדן)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>23-029-361</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה</td><td>תרמו מדעי</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>צינורות אפנדורף</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>1159M35</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Avantor Seradigm</td><td>89510-186</td><td></td></tr><tr><td>לונזה ווקרסוויל&nbsp; SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit L</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0281111</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE&trade; ערכת תמלול T7 ULTRA</td><td>תרמו פישר</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>צינורות רצועת PCR</td><td>ארה"ב מדעי&nbsp;</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>pLG1 ביטוי sgRNA פלסמיד</td><td>Addgene&nbsp;</td><td></td><td></td>217306</tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>22-400-105</td><td></td></tr><tr><td>SF Cell Line 96-well Nucleofector&reg; &nbsp; ערכת</td><td>Lonza</td><td>V4SC-2096</td><td></td></tr><tr><td>חממת תרביות רקמות</td><td>PHCbi</td><td>MCO-170AICUVDL-PA</td><td></td></tr><tr><td>מגיב טרנספקציה TransIT-LTI</td><td>Mirus</td><td>MIR 2306</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco</td><td>25200114</td><td></td></tr></tbody></table>

עריכת אפיגנום crispr בתאים אנושיים באמצעות טרנספקציה של dna פלסמיד והעברת נוקלאופקציה של mrna

CRISPR Epigenome Editing in Human Cells using Plasmid DNA Transfection and mRNA Nucleofection Delivery

עבור כל ניסויי עריכת האפיגנום, בקרות מתאימות הן קריטיות להערכת יעילות עריכת האפיגנום. אנו ממליצים להשתמש ב-sgRNA בקרה, שאינו מכוון לשום רצף בגנום האנושי. שימוש בבקרת מדריך שאינה ממוקדת ייתן ביטחון שהשינויים במיקומי היעד מונעים על ידי עורך האפיגנום המופנה לאתר זה ולא רק מביטוי יתר של עורך האפיגנום או כריכה לא ספציפית. בנוסף, עבור ניסויים מבוססי גנים של מדווחים, אנו מציעים להשתמש בבקרה של dCas9 בלבד כדי להבטיח שהשינויים בביטוי המדווח נובעים ממיזוג עורך אפיגנום ולא מעיכוב סטרי של קשירת dCas9 למיקום המטרה ומעכב זמנית את השעת...

עריכת אפיגנום CRISPR בתאים אנושיים באמצעות טרנספקציה של DNA פלסמיד והעברת נוקלאופקציה של mRNA

Epigenetics refers to chemical modifications of histone proteins and DNA that can regulate the expression of genes. The human epigenome is altered ...

crispr-epigenome-editing-human-cells-using-plasmid-dna-transfection

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

סרטון זה מדגים טכניקה של עריכת גנום מבוסס נוקלאז באצבעות אבץ בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs). מכיוון שניתן להתמיין לתאי גזעי עוברי אורח לסוגי תאים שונים, טכנולוגיה זו מועילה למחקרים פתולוגיים ופרמקולוגיים במבחנה באופן ספציפי למטופל.

Zinc Finger Nuclease-Based Genome Editing: טכניקה לשינוי גנום בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על ידי מנגנון תיקון תלוי הומולוגיה דו-גדילי

עריכת גנום של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) יכולה להיעשות במהירות וביעילות. מוצג כאן הליך ניסיוני חזק להנדסה גנטית של hPSCs כפי שמודגם על ידי עריכת מיקום נמל המבטחים AAVS1 כדי לבטא EGFP ולהציג עמידות לאנטיביוטיקה.

הקמת שורות תאי גזע pluripotent האדם בעריכה-הגנום: ממיקוד לבידוד

פרוטוקול זה מתווה את זרימת העבודה של הגן מבוססת על CRISPR/Cas9 עריכת המערכת עבור התיקון של מוטציות נקודה בתרבית של תאים. כאן, אנו משתמשים בגישה קומבינטורית לעריכת ג'ין עם נתונים היסטוריים אסטרטגיה ניסיוני המשכית למדידת ויאסין היווצרות באתר היעד — בעיקרו של דבר, ניתוח מוטגנזה מכוונת באתר.

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

ניצול של Cas9 preassembled ribonucleoprotein מורכבים (RNP) היא שיטה חזקה לעריכת הגנום מדויק, יעיל. כאן, אנחנו להדגיש השירות שלה על פני מגוון רחב של תאים, אורגניזמים, כולל תאים אנושיים ראשי שני קלאסי והעתידיים דגם אורגניזמים.

הגנום משופרת עריכה עם Cas9 Ribonucleoprotein שונים תאים ואורגניזמים

CRISPR-Cas היא טכנולוגיה רבת עוצמה להנדס הגנום מורכבים של צמחים ובעלי חיים. כאן, אנחנו פירוט נוהל לעריכת ביעילות הגנום האנושי באמצעות endonucleases רשויות אישורים שונים. אנחנו מדגישים שיקולים חשובים ופרמטרים עיצוב כדי למטב את יעילות העריכה.

הגנום עריכה בשורות תאים בתרבית של שימוש CRISPR-Cas

לפלח epigenome DNA עריכה מייצג גישה טיפולית רב-עוצמה. פרוטוקול זה מתאר את הייצור, טיהור, הריכוז של ה-all-in-one וקטורים lentiviral מסתירים את transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A עבור יישומים לעריכת epigenome בתא גזע pluripotent המושרה אנושי (hiPSC)-נגזר נוירונים.

וקטור lentiviral פלטפורמה למסירה יעיל של כלי עריכת Epigenome לתוך האדם המושרה מודלים המחלה נגזר תאי גזע Pluripotent

המוצג כאן הוא פרוטוקול עבור CRISPR/Cas9 ריבונאנאופלפרוטאין מתווך יעיל עריכת גנים בתאי מיונקים באמצעות אלקטרופורציה שפופרת.

CRISPR/Cas9 ריבונואופפרוטאין-תיווך מדויק לעריכה גנטית על ידי אלקטרופורציה

פרוטוקול זה מספק שיטה כדי להקל על הדור של heterozygous או homozygous נוקלאוטיד שינויים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם pluripotent.

הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם Pluripotent

כאן אנו מתארים שיטה מפורטת לעריכת גנים חלקה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות פלסמיד תורם מבוסס piggyBac ומוטנט ניקאז Cas9. שתי מוטציות נקודתיות הוכנסו לאקסון 8 של לוקוס הגורם הגרעיני הפטוציטים 4 אלפא (HNF4α) בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs).

החדרת מוטציות נקודתיות לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות עריכת גנום חלקה

העברת עורכי גנום כ-RNA היא אמצעי עוצמתי במיוחד לשינוי הגנומים של תאי יונקים ראשוניים וקווי תאים. מטרת הפרוטוקול היא להעביר עורכי גנום כ-mRNA לתאים ראשוניים ולקווי תאים ביונקים, ולאחר מכן ריצוף וניתוח ממוקדים של Illumina כדי לכמת את תוצאות העריכה.

עריכת גנום בתאי יונקים ראשוניים באמצעות אלקטרופורציה של RNA עורך

למד עריכת אפיגנום CRISPR בתאים אנושיים באמצעות טרנספקציית DNA פלסמיד והעברת נוקלאופקציה של mRNA. שיטות אלו מאפשרות מודולציה מכוונת של ביטוי גנים ללא שבירות DNA רעילות ומפחיתות רעילות ואי-יציבות גנומית.

עריכת אפיגנום CRISPR בתאים אנושיים באמצעות טרנספקציה של DNA פלסמיד והעברת נוקלאופקציה של mRNA

גלה סרטונים נוספים