ניטור דינמיקת קונפורמציה של חלבונים בודדים לא מותאמים באמצעות פינצטה פלזמונית

מחקר זה נועד לקבל תובנה לגבי חלבונים נטולי תוויות ברמת מולקולה בודדת בזמן אמת, עם דגש מיוחד על חלבונים שמאתגרים לחקור בטכניקות הנוכחיות או שיש להם רלוונטיות למחלות. פינצטה פלזמונית הוכיחה לאחרונה את יכולתה לנטר דינמיקת קונפורמציה בעת קשירה למולקולות קטנות, לבדוק קינטיקה של פירוק ולהבהיר נופי אנרגיה חופשית, הכל ברמת מולקולה בודדת. נכון לעכשיו, אף טכניקת אפיון חלבון מבוססת אינה מסוגלת לחקור דינמיקת קונפורמציה של חלבון חד-מולקולה ללא תווית.

מאמינים כי לפינצטה פלזמונית יש פוטנציאל למלא את הנישה הזו בתחום. יתרון ייחודי זה מסייע לנו לחקור את הקשר בין השינוי הקונפורמטיבי של חלבונים ותפקודיהם הביולוגיים וההשלכות על התפתחות מחלות. המחקר העתידי יתמקד בחלבונים בעלי הפרעות מהותיות וחלבוני ממברנה, שכן רבים מהם מעורבים במספר מחלות כגון אלצהיימר, פרקינסון וסוגי סרטן שונים.

כדי להתחיל, הנח את הדגימה המצופה PEG-thiol בתא הזרימה המודפס בתלת מימד באמצעות פינצטה ישרה, וודא ששכבת הזהב פונה כלפי מעלה. קלף צד אחד של מכסה הסרט הדו-צדדי מפלסטיק PET השקוף. הנח בזהירות את הסרט מעל הדגימה ותא הזרימה, וודא שמבני הננו וחורי היניקה/יציאה בתא הזרימה יישארו חשופים.

בעזרת פינצטה מעוגלת, לחץ בעדינות סביב שולי הסרט כדי להדק את הידבקותו לתא הזרימה והדגימה. קלף את הצד השני של הסרט והניח בעדינות החלקה של מכסה זכוכית מעל הדגימה. השתמש בפינצטה מעוגלת כדי ללחוץ סביב שולי החלקת הכיסוי כדי לאבטח את הידבקותה.

תהליך זה יוצר תעלה נוזלית בתוך תא הזרימה בגובה של 50 מיקרומטר ונפח של 3.5 מיקרוליטר. בעזרת קצה פיפטה קטן, מערבבים חלקים שווים של תמיסה A ותמיסה B של הסיליקון המשוכפל על שקופית מיקרוסקופ ביחס של אחד לאחד או שצוינה על ידי היצרן. מלא את הרווחים בין החלקת הכיסוי לתא הזרימה בעזרת סיליקון משכפל מעורב, ודחף אותו בעדינות מתחת להחלקת הכיסוי.

החזק את תא הזרימה הפוך ומרח בזהירות סיליקון משוכפל סביב הדופן הפנימית של החור. העבר בעדינות את הסיליקון אל הקצוות הגלויים של הצד התחתון של הסיליקה המותכת של הדגימה, והשאיר את הדגימה להתייבש כששכבת הזהב פונה כלפי מעלה עד שהסיליקון המשוכפל מתייצב במלואו. לאחר וידוא שכל הרכיבים מחוברים כהלכה, טען את ממשק המשתמש של המערכת המיקרופלואידית במחשב.

לחץ על סמל ההפעלה שליד מפיץ ה- MUX והחוט, השולטים בשסתום הסיבובי 12 על אחד ובשסתום הדו-כיווני בהתאמה כדי לפתוח את הממשקים המתאימים להם. כדי לעקוף את השסתום התלת-כיווני, הפעל את היציאה הראשונה של החוט. כדי להרכיב את תא הזרימה לתוך פינצטה פלזמונית, חבר את צינורות הכניסה והיציאה לחלקים המתאימים של תא הזרימה.

הנח את תא הזרימה על רקמה נקייה כששכבת הזהב פונה כלפי מעלה. החדירו מאגר לתא הזרימה בקצב זרימה גבוה של כ-0.3 מיליליטר לדקה. בדוק שהנוזל נע על פני הדגימה בתוך תא הזרימה ושלא נראה נוזל בצד החיצוני או התחתון.

מרחו טיפה אחת עד שתיים של שמן טבילה על יעד 100X. הנח את תא הזרימה לשלב הפינצטה הפלזמונית כששכבת הזהב פונה כלפי מטה. אבטח את תא הזרימה באמצעות קליפסים מתכתיים מעל המגנטים ונעל את ה-stagה כדי לשמור אותו במקומו.

הפעל את מקור האור הלבן. פתח את תוכנת המצלמה והתאם את זמן החשיפה והרווח עד שמבני הננו נראים לעין. הפעל את הלייזר בעוצמה גבוהה יחסית והתאם ידנית את ציר ה-Z עד שנקודת הלייזר נראית לעין.

הפעל את הבקר הפיזואלקטרי ובחר את ההגדרות המתאימות עבור יציאת התקשורת והמתח המרבי. הגדר את ערכי ציר X, Y ו-Z למחצית מהמתח המקסימלי כדי לאפשר יישור טוב יותר של הבמה לכל הכיוונים. יישר את נקודת הלייזר עם אחד ממבני הננו הכפולים או DNH באמצעות הראשיtagכפתורי הבקרה של ציר X, Y ו-Z.

ודא שדיודת הצילום של המפולת או ה-APD מופעלים. סגור בעדינות את המארז לפינצטה הפלזמונית. פתח את התוכנה המשויכת להקלטת APD, כגון ממשק משתמש תוצרת בית של LabVIEW. ערוך את שם הקובץ והגדר את תדירות הניתוק לקילו-הרץ אחד.

לאחר מכן ציין את נתיב הקובץ הרצוי שבו יישמרו הקבצים. כבה את מקור האור הלבן והפעל שוב את הלייזר. לאחר הגדרת עוצמת הלייזר לרמה מתאימה, השתמש בפקדים הפיזואלקטריים כדי לכוונן את צירי X, Y ו-Z עד שאות ה-APD יהיה גבוה ככל האפשר.

הימנעות מרוויה של APD ועם סטיית תקן מינימלית של המעקב. לאחר מכן, כבה את הלייזר כדי לשמר את תוחלת החיים של מבני הננו. הפעל את יחידת הבקרה של משאבת המזרק ואת ממשק המשתמש של המפיץ כדי להגדיר את השסתום ולמשוך את כמות החלבון הרצויה.

באמצעות ממשק המשתמש המיקרופלואידי, החדירו את תמיסת החלבון בקצב זרימה דומה לקצב הנסיגה. המשך בעירוי בקצב זה עד שתמיסת החלבון תגיע לתא הזרימה. לאחר מכן הגדר את קצב הזרימה לערך מתאים ללכידה והמתן לייצוב העקבות.

ודא שהנפח והזמן במשאבת המזרק תואמים לערכים הצפויים. כדי להקליט את נתוני האות של APD, כוונן את צירי X, Y ו-Z לפי הצורך באמצעות ממשק המשתמש של הבקר הפיזואלקטרי. לאחר צפייה בשינוי גדול בשידור ובסטיית התקן, רשום את הזמן שזה מתרחש למיון נתונים עתידי. אם יש צורך לשחרר את החלבון כחלק מהניסוי, כבה את הלייזר למשך כחמש שניות ולאחר מכן הפעל אותו שוב.

העקבה צריכה להיות בעלת שינוי גדול בשידור וסטיית תקן נמוכה משמעותית, מה שמעיד על חזרה למצב הבסיס. לאחר השלמת הניסוי, כבה את הלייזר. הסר את תא הזרימה משלב שלושת הצירים ונתק את צינורות המערכת המיקרופלואידית.

הנח את תא הזרימה על רקמה נקייה כששכבת הזהב פונה כלפי מעלה. בעזרת אזמל, חותכים בזהירות את הדבק מתחת להחלקת מכסה הזכוכית לפני שמרימים אותו בעדינות ומשליכים אותו. החזק את תא הזרימה בזווית כששכבת הזהב עדיין פונה כלפי מעלה והשתמש בפינצטה מעוגלת כדי להסיר בזהירות את הדבק מהצד התחתון של תא הזרימה כדי לשחרר את הדגימה.

בעזרת פינצטה ישרה, הרם את הדגימה ושטוף אותה היטב עם איזופרופנול. יבש את הדגימה באמצעות אקדח אוויר. ניסוי מייצג שבוצע על העמסת ברזל במקום למולקולת אפופריטין מדגים את השימוש בפינצטה פלזמונית ככלי לחקירת דינמיקת קונפורמציה של חלבונים.

עקבות ההעברה של אפופריטין נשארים יציבים כאשר הם נלכדים בתמיסת PBS, מה שמעיד על כך שאין שינויים קונפורמטיביים משמעותיים. עם החשיפה לתמיסת הברזל, התנודות בסטיות התקן של העקבות גדלו, מה שמעיד על שינויים מבניים דינמיים הקשורים להעמסת ברזל. לאחר 20 דקות של חשיפה לברזל, עקבות ההולכה התייצבו, מה שמצביע על המעבר של אפופריטין להולופורם שלו.

תרשימי פונקציית צפיפות ההסתברות הדגימו שינוי בחלוקת המתח בעת העמסת ברזל, ותמכו עוד יותר במעבר הקונפורמציה מאפופריטין להולופריטין.