פנים פנים הקפאה של רשתית עכבר לניתוח מרחבי מרחבי בממדים גבוהים

הרשתית היא מודל שימושי להבנת חישובים עצביים. חישובים אלה תלויים במיקומים המיוחדים של התאים. עם זאת, מפות מקיפות של זה נותרו חמקמקות.

במהלך העשור האחרון, ריצוף תאים בודדים סיפק תיאורים ברורים של סוגי תאי רשתית. כעת, טרנסקריפטומיקה מרחבית מספקת דרך חדשה להשתמש בתיאורים אלה ברקמה שלמה. אתגר קריטי לשימוש בתעתיק מרחבי הוא שהם דורשים קטעי רקמה דקים מאוד. הרשתית כבר דקה למדי במישור האופקי בו אנו מעוניינים.

על ידי המצאת שיטה זו ליצירת חתכים דקים ומהירים, להשתמש בתעתיק מרחבי בלמידת מכונה כדי למפות את כל תאי הגנגליון ברשתית באותה רקמה. במהלך 30 השנים האחרונות, רק 17 מתוך 45 תאי גנגליון ברשתית של עכברים מופו, והטכניקה הזו אפשרה לנו למפות את כולם בבת אחת.

[מדריך] כדי להתחיל, הניחו עכבר שהורדם על שולחן העבודה. הרצתי את הקוטב הטמפורלי של הגלובוס על הקרנית כדי לשמור על התמצאות וליצור נקודת תורפה לדיסקציה. טבלו את הגלובוס וכוונו את הפתרון בצלחת המכילה פיסת נייר פילטר. בעזרת מלקחיים חדים מספר חמש ומספריים לאיריס הסר בזהירות את כל השרירים, הפאשיה, כלי הדם והעצבים מהגלובוס מבלי לנקב את הסקלרה. מקם את קצה להב המספריים של איריס אחד בניצב למותג הקרנית. נקב את הגלובוס במיקום זה. בצע חתך נקי יחיד דרך הקרנית והלימבוס, והמשיך לתוך הסקלרה והרשתית לכיוון ראש עצב הראייה. לאחר מכן מקם את הלהב בניצב לחיתוך הראשוני, כמילימטר אחד אחורי ללימבוס. התחל לחתוך באופן רדיאלי דרך הסקלרה והרשתית. שמור על קו חיתוך עקבי אחורי ומקביל ללימבוס על ידי שימוש במלקחיים חדים כדי להנחות ולסובב את הגלובוס. אם הרשתית והסקלרה נפרדות, מקם מחדש את להב המספריים של הקשתית כדי לחתוך אותם יחד. הערך את המרחק האחורי של מילימטר אחד באמצעות הרוחב האמצעי של להב המספריים של הקשתית לאחר השלמת החיתוך הרדיאלי במקביל ללימבוס, בדוק אם נותרו חיבורי הרשתית. חתוך אותם בזהירות עם מספריים של קשתית עד שחלקי הגלובוס הקדמיים והאחוריים נפרדים. לאחר מכן, השתמש בשני זוגות של מלקחיים חדים מספר חמש כדי להפריד בעדינות בין החלקים הקדמיים והאחוריים של הגלובוס. בעכברים מבוגרים יותר, אם סיבים שקופים מחברים את העדשה לכוס הרשתית, חתכו אותם בזהירות עם מספריים לקשתית תוך מזעור ההפרדה הסקלרית ברשתית. בעזרת נייר הסינון כפלטפורמת תמיכה, חותכים את הרשתית לעלה תלתן, הנקרא גם דפוס צלב ברזל עם מספריים לאיריס. חזור על הדיסקציה בעין השנייה. חותכים את הקצה של פיפטת העברה חד פעמית מפלסטיק כדי ליצור פתח גדול יותר מהרשתית והסקלרה המנותחות. שאבו בעדינות את הרשתית לתוך הפיפטה והניחו אותה על שקופית מיקרוסקופ זכוכית. בעזרת מגבון מעבדה, הסר את תמיסת הכיוון העודפת עד שהרשתית כבר לא צפה וניתן לשטח אותה. כעת השתמשו בשני מלקחיים חדים מספר חמש כדי לפרוש את הרשתית ולמקם אותה שטוחה כשכוס העין הפנימית פונה כלפי מעלה. בצע חתכי הקלה באורך של 0.5 עד שני מילימטרים בכל קטע תלתן כדי לסייע בהשטחה ולהתאים למניעת קיפול. הסר את כל תמיסת המטרה שנותרה למעט הנוזל הסמוך לרשתית. בעזרת פתק כיסוי, לחצו במהירות והעבירו את הרשתית כך שהסקלרה החיצונית פונה כלפי מעלה וכוס העין הפנימית תהיה במגע עם החלקת הכיסוי. ודא שהרשתית אינה מקופלת ובצע התאמות במידת הצורך. יש להוסיף תמיסת מטרה כדי לסייע במניפולציה, אך יש להסיר עודפים בעזרת מגבון כדי למנוע סלסול ולאפשר ייבוש באוויר למשך חמש עד 10 שניות. כעת יש למרוח מדיום OCT כדי לכסות את הרשתית. לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי לפזר את השכבה באופן שווה על פני החלקת הכיסוי כדי למנוע ציפה. הקפיא את הרשתית במדיום OCT באמצעות לוחית מתכת מקוררת באדי חנקן נוזלי, או על ידי מגע ישיר עם קרח יבש. אחסן את הרשתית הקפואה על קרח יבש לשימוש מיידי. לצורך הקפאה, צור כיפת OCT על צ'אק הדגימה, התופסת את שתיים עד שלוש הטבעות הפנימיות אם משתמשים באותו דגם קריוסטט. יישר את צ'אק הדגימה שטוח למשטח החיתוך. צור או שים לב למדריך ההתמצאות המקשר בין הצ'אק לשלב הקריוסטט. לאחר מכן חתוך את הכיפה ליצירת משטח שטוח במקביל ללהב. בעזרת סכין גילוח הסירו עודפי OCT לרוחב והפרידו בזהירות את הרשתית מהחלקת הכיסוי כדי להפוך אותה לניידת. הסר את הצ'אק מה-Stage ומרח טיפה קטנה של OCT נוזלי על משטח ה-OCT השטוח המוכן. לאחר מכן, הניחו את הרשתית ישירות על ה-OCT הנוזלי. השתמשו בשקופית זכוכית מקוררת מראש כדי ללחוץ ולהחזיק את הרשתית עד להקפאה. מרחו יותר OCT על הרשתית והצ'אק כדי להבטיח הדבקה. לאחר מכן הקפיאו את המכלול באזור ההקפאה המהירה של הקריוסטט. לצורך חיתוך, יש לחתוך בזהירות את עודפי ה-OCT עד שהרשתית נראית לעין. השתמש בסכין גילוח כדי לעצב את קצוות בלוק ה-OCT קרוב לרשתית. המשך לקצץ תוך כדי בדיקת נוכחות סקלרה. כאשר הסקלרה נראית לעין, התאם את זווית הבמה לפי הצורך. הפסק לקצץ כאשר הסקלרה מפוזרת באופן שווה בין מקטעים. כעת, השתמש בשקופיות מקוררות מראש ובשתי מברשות צבע כדי לתפעל את החלקים ולאסוף אותם. הניחו אצבע מתחת לחלק למשך כחמש שניות עד שה-OCT נמס ונצמד לשקף. לאחר מכן החזירו את השקופית למשטח קר להקפאה מחדש. אחסן את השקופיות המוכנות על קרח יבש לשימוש מיידי. תגובתיות חיסונית מובהקת או RBPMS בשכבת תאי הגנגליון והפרדה ברורה של מקלעת כלי הדם המסומנת על ידי לקטין עגבניות אישרו שימור מוצלח של למינציה ברשתית וסמני חלבון. זיהוי RNA מרובה באמצעות פאנל היקף RNA 12 plex שמר בהצלחה על מבנה מרחבי וחשף ביטוי מובהק של סמנים כגון Grm6 ו-RBPMS על פני פרוסת הפנים. תמונות ברזולוציה גבוהה אישרו דפוסי ביטוי של תא בודד עבור RBPMS וסמנים אחרים כמו Mafb6 ו-Meis2, ואישרו את לוקליזציה של חלבון ו-RNA בשכבת תאי הגנגליון. התפלגות אותות אחידה על פני קטעי השארת תלתן ואותות חזקים בנתונים טרנסקריפטומיים מרחביים של קסניום אישרו פרופיל מוצלח בתפוקה גבוהה ושלמות RNA. הדמיה ברזולוציה של תא בודד באמצעות דפוסי זיהוי ידניים תואמת קסניום המאשרת את חוסן הפרוטוקול על פני פלטפורמות. סמני תעתיק ספציפיים לסוג התא הראו התפלגות למינרית מרובדת בחתך הרשתית ובמיפוי פנים, ושמרו על מיקומם על פני עומקים. זום מפורט לשכבת תאי הגנגליון אישר זיהוי תעתיק מרחבי מדויק ביחס לצביעה גרעינית DAPI.