הדמיה ברזולוציה גבוהה של C. elegans בכל שלבי הזחל

במעבדה אנו עובדים על כל מיני שאלות בביולוגיה התפתחותית. אני עצמי עובד יותר על הצד הטכני, מפתח שיטות להתמודד טוב יותר עם השאלות הללו באמצעות טכניקות הדמיה. תחום C. elegans אימץ בהצלחה מגוון עצום של שיטות, החל מעריכת גנים CRISPR, טרנסקריפטומיקה ופרוטאומיקה, ועד למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. C. elegans הוא מודל מדהים, אולם בהקשר של תצפית in vivo ברזולוציה גבוהה, הוא מגיע עם האתגרים שלו, הדורשים קיבוע לרזולוציה הטובה ביותר, מה שבתורו מגביל את יכולת הקיום של בעלי החיים. הפרוטוקול מציג פתרון אפשרי אחד להדמיה ארוכת טווח של C. elegans, ומאפשר לחוקרים לאמץ את השיטה במעבדה שלהם ולחקור מגוון רחב של תהליכי התפתחות דינמיים ישירות in vivo. בתוך המעבדה, השיטה אפשרה תצפית מפורטת על היווצרות איברים, למשל, בהקשר של מורפוגנזה או בעקבות חלוקת תאים סומטיים לבגרות. השיטה אומצה מאז על ידי מעבדות רבות החוקרות מגוון רחב של תהליכי התפתחות.

[מגישה] כדי להתחיל, חבר את המכשיר למסגרת התמיכה והרכיב אותו על המיקרוסקופ הזקוף. מלאו מזרק במים נטולי יונים, ולאחר מכן חברו מחט בגודל 23 וחתיכה ארוכה של צינור בגודל 16 אינץ' עם סיכת פלדה כפופה חלולה. מלאו את הצינור במים נטולי יונים מהמזרק והכנסו את סיכת הפלדה לחור האגרוף של כניסת השסתום כדי לחבר את הצינור. הסר את המזרק והמחט לפני חיבור הצינור לסולנואיד מחוץ לשבב. באמצעות תוכנת ההדמיה, הפעל את הסולנואיד ולחץ על המכשיר למשך מספר דקות כדי להוציא את כל האוויר מהשסתום. ודא את ההשלמה על ידי בדיקה ויזואלית שממשק מי האוויר נראה כהה ונעלם לתוך חומר ה-PDMS. כבה את הסולנואיד באמצעות תוכנת ההדמיה. לאחר מכן, מלאו מזרק של מיליליטר אחד בתמיסת החיידקים המסוננים והצמידו למחט מחט בגודל 30 וחתיכה ארוכה של צינור בגודל 32 אינץ'. לחץ על הבוכנה כדי למלא גם את המחט וגם את הצינור המחובר בתמיסת החיידקים. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, הכנס את הצינור בגודל 1 על 32 אינץ' ישירות לכניסת המזון של המכשיר המיקרופלואידי והנח את המזרק על משאבת המזרק. לחץ על בוכנת המזרק באמצעות בורג האגודל מאחור כדי למלא את המכשיר בנוזל. חסום את כניסת ויציאת התולעת עם סיכות פלדה אטומות והפעל לחץ נוסף באמצעות בורג הסט כדי להסיר את כל האוויר שנותר מהמכשיר. לאחר מכן הסר את סיכת הפלדה החסומה בשקע והצמד את מיכל הפסולת לשקע. דחוף את המזרק כדי לוודא שמיכל הפסולת מחובר כהלכה ושאין סתימות במערכת. הסר את סיכת הפלדה החסומה השנייה מהכניסה ודחף את המזרק עד להופעת טיפת נוזל קטנה בכניסת התולעת. לאחר מכן, בעזרת מחט בגודל 23, חבר חתיכה ארוכה יותר של צינור בגודל 16 אינץ' בגודל של כ-15 עד 20 סנטימטרים למזרק של מיליליטר מלא במאגר S-בסיסי. חבר סיכת פלדה ישרה בגודל 23 לקצה השני של הצינור. מלאו את המחט והצינור במאגר S-בזאלי מהמזרק. כעת, הכנס את סיכת הפלדה בקצה הצינור לתוך הצינור המכיל את התולעים, ודחף כמות קטנה של נוזל דרך הצינור כדי להבטיח שלא יישאר אוויר. משוך את התולעים לתוך הצינור מבלי למשוך אותן לתוך המזרק. לאחר מכן דחוף את המזרק המחובר לתולעים עד שתופיע טיפת נוזל קטנה על סיכת הפלדה והכנס את סיכת הפלדה לכניסת התולעת של המכשיר המיקרופלואידי. הנח את המכשיר על מיקרוסקופ בהגדלה נמוכה, פי 5 או פי 10, או על מיקרוסקופ דיסקציה. מקם את ההתקן כך שהכניסה נראית בצד אחד של שדה הראייה והחלק האחורי של כניסת תעלת המלכודת נראה בצד השני. לחץ בעדינות על הבוכנה של מזרק התולעת. לאחר מכן, דחף את בעלי החיים לכיוון מערך הערוצים. ברגע שבעל חיים פונה לערוץ, דחפו אותו לתוך התעלה וחזרו על הפעולה עבור בעלי חיים נוספים. לאחר לכידת מספיק בעלי חיים, הנח את המזרק, שעדיין מחובר לכניסת התולעת על במת המיקרוסקופ, שם הוא יישאר לאורך כל הניסוי. אם בוצעה טעינה במיקרוסקופ דיסקציה, העבר את המכשיר למיקרוסקופ ההדמיה. כעת, הפעל את משאבת המזרק והפעל אותה בקצב מוגדר מראש של מיקרוליטר אחד לשעה עבור 0.5 מיקרוליטר. תכנת את משאבת המזרק כך שהיא תפעל במיקרוליטר אחד לשעה עבור 0.5 מיקרוליטר, ולאחר מכן קצב הזרימה מוגבר ב-100 מיקרוליטר לשעה עבור 0.5 מיקרוליטר, ודפוס הזרימה חוזר על עצמו לאורך כל הניסוי. הנח את המכשיר על המיקרוסקופ tagוודא שהוא מוחזק היטב. עבור להגדלת ההדמיה הרצויה. זהה את בעלי החיים ואזורי העניין במערך ערוצי הלכידה והגדר את תנאי ההדמיה הרצויים. תמונה בתנאי ההדמיה הרצויים, הפעלת השסתום על השבב דרך הסולנואיד 10 שניות לפני רכישת התמונה כך שבעלי החיים מוחזקים במקומם. המכשיר המיקרופלואידי שמר על איכות הדמיה גבוהה על פני שיטות מיקרוסקופיה שונות, כולל שדה בהיר, אפיפלואורסצנטי, קונפוקל דיסק מסתובב ושיטות סופר רזולוציה עקב שימוש בזכוכית כיסוי בעובי 170 מיקרומטר. התפתחות תאי אפיתל של Caenorhabditis elegans נראית מתחילת L1 עד אמצע שלב הזחל L2. ניכרת אינדוקציה של תאי הפות הראשוניים הדהויים וחלוקתם לאחר מכן משלהי L1 לשלב הזחל המוקדם של L4. שלבי היווצרות הפות מתחילת L3 ועד לבגרות. התמונות שנרכשו שופרו באמצעות דה-קונבולוציה ורישום תמונה, ושיפרו את הבהירות החזותית חלוקות תאים שנראו התרחשו באופן עקבי ובזמן על פני כל בעלי החיים, כאשר כל החלוקות הושלמו במשכי זמן טיפוסיים של שלב הזחל. אורך בלוטת המין גדל בהתמדה במהלך שלבי L2 ו-L3 עם מדידות עקביות שהתאפשרו על ידי כיוון ישר של בעלי חיים.