העברת גנים וביטוי משופרים באמצעות הזרקה תוך גרמית של חלקיקי צ'יטוזן עטופים בעריכת אדנין בסיס פלסמידים

אנו מציעים שיטת ריפוי גנטי המעבירה ישירות את Editor Chitosan מבוסס אדנין למח העצם באמצעות הזרקה תוך גרמית. יעילות הטרנספקציה של פלסמידים אקסוגניים לחיות ניסוי נמוכה יחסית והכנסת פלסמידים לביטוי גנים לטווח ארוך עשויה להיות מושפעת ממערכת החיסון. אנו משתמשים בצ'יטוזן כדי לעטוף פלסמידים של עורך מבוסס אדנין והעברנו ישירות את הקומפלקס למח העצם של עכברים באמצעות הזרקה תוך גרמית, מה שהופך אותו למתאים למחלות הנגרמות על ידי תפקוד לא תקין של אוסטאוקלסט.

הפרוטוקול שלנו מציע יעילות טרנספקציה גבוהה, נזק ביולוגי קטן ויעילות ביטוי גנים גבוהה. האסטרטגיה החדשנית שלנו מתאימה לא רק למחלות הנגרמות על ידי תפקוד לא תקין של אוסטאוקלסטים, אלא גם בעלת פוטנציאל משמעותי לקידום תחום הריפוי הגנטי. כדי להתחיל, הניחו עכבר שעבר המתת חסד על שולחן עבודה.

בעזרת מספריים ופינצטה כירורגיים, הסר את השוקה והפשיט את כל רקמת השריר שמסביב. משרים את השוקה הנקייה ב-PBS ושוטפים עד שנשארת רק העצם. משוך מיליליטר אחד של PBS למזרק ושטוף את תאי מח העצם מקצה אחד של השוקה עד שהעצם הופכת לבנה לחלוטין.

לאחר מכן, אספו את תרחיף התאים בצינור. צנטריפוגה בטמפרטורה של 800 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר הוצאת הסופרנטנט, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר ליזה של כדוריות דם אדומות לגלולה.

לאחר דקה, הוסף מיליליטר אחד של מאגר הפרדה כדי לסיים את הליזה. צנטריפוגה את המתלה שוב ב 800 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. הסר את הסופרנטנט והניח את כדור התא שנוצר על קרח לשימוש מאוחר יותר.

עבור טרנספקציה של צ'יטוזן ממיסים ארבעה מיליגרם של צ'יטוזן ב-20 מיליליטר של תמיסת חומצה אצטית. התאם את ה-pH ל-5.5 באמצעות 10 נתרן הידרוקסיד מולארי. לאחר מכן הוציאו 500 מיקרוליטר מתמיסת הצ'יטוזן לצינורות מיקרו צנטריפוגה בודדים.

כעת הוסף שניים, שלושה, ארבעה וחמישה מיקרוגרם של פלסמידים ABE לצינורות בודדים. ממיסים את הפלסמידים ב -500 מיקרוליטר של נתרן גופרתי 30 מילימולרי. לאחר מכן מערבבים 500 מיקרוליטר תמיסת פלסמיד עם 500 מיקרוליטר תמיסת צ'יטוזן בצינורות מתאימים.

דגרו את הצינורות באמבט מים בטמפרטורה של 50 עד 55 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. מערבל כל צינור למשך 15 עד 30 שניות ותן להם לעמוד ללא הפרעה במשך 30 דקות. לאפיון, נתח את הקוטר ופוטנציאל הזטה של צ'יטוזן באמצעות פיזור אור דינמי.

שמור על ריכוז הצ'יטוזן על 0.1 מיליגרם למיליליטר במים מזוקקים כפולים. לאחר מכן, יצוק 0.1 מיליגרם למיליליטר דגימות צ'יטוזן על שבב סיליקון. הוסף 20 מיקרוליטר מהדגימות התלויות על 200 רשתות רשת ודגר.

תרחיף תאי מח עצם צנטריפוגה ב-800 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. השליכו את הסופרנטנט, ואז הוסיפו 500 מיקרוליטר של ליזאט כדוריות דם אדומות. לאחר דקה, הוסף מיליליטר אחד של מאגר הפרדה כדי לעצור את התגובה.

לאחר מכן ספור את מספר התאים עם מונה תאים. לאחר מכן, העבירו מיליון תאים לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש. לאחר צנטריפוגה שוב, פיפטה החוצה את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר של PBS.

העבר את התאים התלויים לתוך צינור ציטומטריית זרימה ומדוד את יעילות הטרנספקציה באמצעות ציטומטריית זרימה. להזרקת חלל מח עצם, תקן את העכבר המורדם במצב שכיבה על שולחן הניתוחים. השתמש בנייר דבק כדי להדק את הגפה הקדמית במקומה.

יש לחטא את השוקה האחורית באמצעות ספוגית אלכוהול. לאחר מכן טען את תמיסת הפלסמיד למזרק מיליליטר אחד המצויד במחט בגודל 26. הסר את כל בועות האוויר ושמור את המזרק מוכן להזרקה.

לאחר מכן, גע וייצב את שוק העכבר בעזרת האצבעות. מקם את מחט ההזרקה כדי להיכנס לציר השוק מרמת השוקה ליד מפרק הברך. כעת סובב את המחט במקביל לשוקה, הכנס לחלל מח העצם והזריק לאט במשך שלוש שניות.

לאחר ההזרקה, משוך לאט את המחט במשך שלוש שניות. יש לחטא מיד את מקום הניקוב באמצעות ספוגית אלכוהול כדי לעצור כל דימום. הנח את העכבר בסביבה חמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להקל על התאוששותו.

לננו-חלקיקים שנוצרו עם הפלסמידים ABE ו-GRNA הייתה מורפולוגיה כדורית אחידה והתפלגות גודל צרה בגודל ממוצע של 202.9 ננומטר. פוטנציאל זטה של 2.77 מילי-וולט ואינדקס פיזור פולי של 0.22. פלסמיד ABE משובץ צ'יטוזן שיפר משמעותית את האות הפלואורסצנטי בתאי מח העצם, מה שמצביע על יעילות טרנספקציה גבוהה יותר בהשוואה לקבוצת הביקורת.

ציטומטריית זרימה אישרה כי פלסמיד ABE מקודד צ'יטוזן השיג יעילות טרנספקציה גבוהה בתאי מח עצם. עם יעילות שיא של 51.2% שנצפתה במינון של ארבעה מיקרוגרם, בעוד ששלושה מיקרוגרם סיפקו איזון של יעילות גבוהה של 47.2% ריצוף סנגר ו-PCR של DNA גנומי של תאי מח עצם שנחשף בעריכת גנים in vivo באתר היעד A1 ביעילות של 14.27% ובאתר A2 עם יעילות של 10.69%.