בדיקה אימונוכימית מאומתת לקביעה מקיפה של קולטן גורם הגדילה האפידרמלי האנושי 2 המשתחרר מהתאים וקשור אליהם

אנו מציגים כריך מתוקף, ELISA, תוך שימוש בנוגדנים חד-שבטיים חדשים, המאפשרים כימות מדויק של התחום החוץ-תאי הקשור ומשוחרר של חלבון HER2 עבור תאים בתרבית חוץ גופית ודגימות חולים.

הפרוטוקול עונה על הצורך בבדיקה מדויקת ומאומתת כדי לתאם את ריכוז חלבון HER2 במחזור עם ביטויים קליניים של מחלה באבחון ובמחקר.

טווח עבודה רחב של הבדיקה, מגוון סוגי הדגימות ואמינות התוצאות עשויים לפתוח הזדמנויות חדשות לניתוח מקיף של מצב הקולטן במודלים in vitro ו-in vivo.

ה-ELISA שפותח ישמש לכימות של HER2 המשתחרר מרקמות סרטניות להפרשות שונות של גוף האדם כמו דם, נוזלי צפק, או ריר.

[מדריך] כדי להתחיל לנתק את התאים באמצעות טריפסין לאחר שהם מגיעים למפגש של 80% ולאסוף אותם לצינור חרוטי נפרד של 15 מיליליטר. לאחר ספירת התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי וזרע שלוש פעמים 10 בחזקת חמישה תאים לבאר בצלחת של 12 בארות עם מיליליטר אחד של מצע גידול. דגרו את התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה המכילה 5% פחמן דו חמצני. מהתרבית של 24 שעות, אוספים את מדיום התרבות מבאר אחת של כל קו תאים לתוך צינור של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את הדגימות שנאספו ב-10,000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ומעבירה את הסופרנטנט לצינור חדש לאחסון במינוס 20 מעלות צלזיוס. שוטפים את התאים הנותרים בכל באר עם מיליליטר PBS קר, שואפים בעדינות וזורקים את ה- PBS. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטר של מאגר RIPA, בתוספת מעכב פרוטאז 1% לכל באר ודגרו למשך חמש דקות. כעת, מגרדים את התאים בעזרת מגרד תאים ומערבבים את הליזאט על ידי פיפטינג מספר פעמים להומוגניזציה. אסוף את התאים הליזים לצינור חדש ושאב לאט את הדגימה למזרק של שני מיליליטר המצויד במחט בגודל 21 בגודל 0.8 על 40 מילימטרים. לאחר שאיפה חמש עד 10 פעמים, צנטריפוגה את הדגימות שנאספו ב-10,000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ומעבירה את הסופרנטנט לצינור חדש לאחסון במינוס 20 מעלות צלזיוס. לדלל את הנוגדן הלוכד Anti-HER2 למיקרוגרם אחד למיליליטר במאגר קידוד. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים הלוכדת לכל באר של צלחת ELISA של 96 בארות. מכסים את הצלחת בסרט איטום. דגרו את הצלחת למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה למשך הלילה, הניחו את הצלחת בטמפרטורת החדר על שייקר מיקרופלייט אופקי למשך שעה. בעזרת מכונת כביסה מיקרופלייט, שאפו את תמיסת הציפוי ושטפו כל באר שלוש פעמים עם 300 מיקרוליטר PBST. לאחר מכן, בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר חוסם המכיל 5% חלב יבש ללא שומן ב-PBS לכל באר מצופה כדי לחסום אתרי קישור לא ספציפיים. כעת, הכינו את עקומת הכיול והשליטה החיובית. הוסף שני מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר, תמיסת מלאי HER2 ל-1,998 מיקרוליטר PBS כדי ליצור 1000 ננוגרם למיליליטר תקן עבודה. עבור שני סטנדרטיים, הוסף 500 מיקרוליטר של אחד סטנדרטי ל-500 מיקרוליטר של PBS וערבב היטב כדי להשיג ריכוז של 50 ננוגרם למיליליטר. הכן דילול סדרתי ליצירת תקנים שלוש עד שבע. לאחר מכן, הכינו דגימות מטריצה באמצעות ליזטים של תאי PBS ומדיום תרבית עם ריכוזי HER2 ידועים. דילול תאים אחד עד 2000 עם 2.5 מיקרוליטר ליזאט וחמישה מיליליטר PBS כדי להשיג רמות HER2 מתחת לגבול הזיהוי. להכנת תמיסה של שני ננוגרם למיליליטר, הוסף שמונה מיקרוליטר של אחד סטנדרטי ל-392 מיקרוליטר של מדיום תרבית PBS או ליזאט תאים וערבב היטב. בעזרת פיפטה חד-ערוצית, הוסף 100 מיקרוליטר של PBS ריק סטנדרטי ובדוק דגימות כל אחת בשלוש פעמים לבארות שלהן של צלחת ELISA המצופה והחסומה. לאחר שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס בתא לחות, שטפו את הצלחת בעזרת מכונת כביסה מיקרופלייט. כדי לזהות קשירת נוגדנים, יש לדלל את הנוגדן המזהה ביוטיניל ב-PBS לריכוז עבודה של מיקרוגרם אחד למיליליטר. לאחר מכן, באמצעות פיפטה רב-ערוצית, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים לזיהוי זו לכל באר. לאחר מכן יש לדלל את ה-AVID וה-HRP המצמידים אחד ל-40,000 ב-40 מיליליטר של PBST. בעזרת פיפטה רב ערוצית, הוסף 100 מיקרוליטר מהמצומד המדולל לכל באר. לאחר הדגירה ושטיפת הצלחת, השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף 100 מיקרוליטר של מצע 3,3 5,5 טטרמתיל-בנזידין לכל באר כדי ליזום את התגובה המטרית של הצבע. לאחר מכן, מכסים את הצלחת בסרט איטום. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה עד חמש דקות, והגנו עליה מפני אור תוך ניטור התפתחות הצבע. כאשר מגיעים לעוצמת הצבע הרצויה, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת עצירה לכל באר כדי לסיים את התגובה. לבסוף, מדוד את הספיגה ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות. באמצעות עקומת כיול של ארבעה פרמטרים, חשב את ריכוז הדגימה על סמך משוואת העקומה. הכריך שפותח, ELISA, הדגים טווח עבודה לחלבון HER2 בין 1.56 ל-100 ננוגרם למיליליטר עם מקדם קביעה של אחד המצביע על התאמה מצוינת. ריכוז ה-HER2 במדיום התרבית עלה עם הזמן עבור כל קווי התאים שנבדקו עם הערכים הגבוהים ביותר לאחר 72 שעות. תאי SK-OV-3 ו-SK-BR-3 הראו ריכוזי HER2 גבוהים פי עשרה ופי 50, בהתאמה, בהשוואה לתאי MDA-MB-231 במדיום התרבית לאחר 24 שעות. באופן דומה, רמות HER2 בליזטים היו גבוהות פי שלושה ופי חמישה עבור SK-OV-3 ו-SK-BR-3, בהתאמה. מעניין שמדיום תרבית התאים הכיל ריכוזים נמוכים פי 1000 של האנטיגן שנבדק בהשוואה לחלבון הקשור לממברנה שנמצא בליזטים של תאים שלמים.