שינוי אנזימטי והערכת ציטומטריית זרימה של חלבונים המוצגים על פני השטח של שמרים

מחקר זה מתמקד בחקר השינויים הכימיים בחלבונים המכתיבים כיצד תאים מתנהגים. במקרה זה, המטרה היא להבין את ההעדפות והקינטיקה של אנזימים המשנים מגוון סובסטרטים.

היכולת לזרחן מולקולת סובסטרט המוצגת על פני השמרים הוכחה לראשונה. ממצא זה פותח אפשרויות למיפוי קינטי הניתן להכללה של שינויים אנזימטיים שלא היו נגישים בעבר. מחקר זה עוסק באתגרים הקשורים להבנת אינטראקציות סובסטרט אנזימים. בדרך כלל, ליזטים של תאים או פפטידים מותאמים אישית נדרשים לסוג זה של הערכה. כאן, חלופה של FasL מסופקת באמצעות שימוש במצעים המוצגים בשמרים.

פרוטוקול זה מקדם את תצוגת פני השטח המסורתית של שמרים לקראת ניתוח של מה שבדרך כלל יהיו תגובות אנזימטיות תוך-תאיות במרחב החוץ-תאי, ומאפשר ניתוח FasL של אינטראקציות קשות להערכה בדרך כלל.

פרוטוקול זה מאפשר לחקור את העדפות הסובסטרט של מגוון אנזימים באמצעות שיטות תפוקה גבוהות ולבצע מחקרים קינטיים עם קריאה פשוטה.

[מדריך] כדי להתחיל, יש להפשיר כמות של תאי השמרים המוכנים על קרח. הוסף 0.5 עד 1.5 מיקרוגרם של DNA פלסמיד המכיל את מבנה תצוגת השמרים ישירות לתאים. לאחר מכן הוסף 0.5 מיליליטר מתמיסת הטרנספורמציה או תמיסת ליתיום אצטט סטרילית של 50% ו-0.1 ליתיום אצטט מולארי. שלב היטב את תערובת התאים, DNA פלסמיד ותמיסת טרנספורמציה על ידי פיפטינג. דגרו את תערובת הטרנספורמציה באופן סטטי במשך 30 עד 60 דקות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, ומערבלו את התערובת במרווחים של 15 דקות. קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה ב -1000 גרם. הכן צינור תרבית של 14 מיליליטר עם 4.5 מיליליטר של גידול תאי שמרים המכילים פלסמיד, או מדיה SDCAA. השעו מחדש את התאים המכילים את הפלסמיד הרצוי ב -500 מיקרוליטר של SDCAA וחסן את 4.5 מיליליטר המדיה המוכנים. מחלקים 50 מיקרוליטר מחמשת מיליליטר התרבית המחוסנת על צלחת SDCAA בזהירות מבלי לנקב את המקדחה. דגירה סטטית ב-30 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות כדי לקבוע את יעילות הטרנספורמציה. כעת, דגרו את חמשת המיליליטר של תרבית תאי SDCAA באינקובטור רועד בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ו-300 סל"ד למשך 18 שעות לפחות. עקוב אחר הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר לאחר 16 שעות, וחזור שוב לאחר 20 שעות. ברגע שהדגימה מגיעה לצפיפות אופטית שאינה עולה על שש, צנטריפוגה את התרבית למשך שלוש דקות ב-2500 גרם, והשליכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור השמרים. השעו מחדש את גלולת השמרים באינדוקציה של ביטוי חלבון, או מדיה SRGCAA, לצפיפות אופטית סופית ב-600 ננומטר פחות מאחת. דגרו את תרבית השמרים בחממה רועדת בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ו-300 סל"ד למשך שמונה שעות לפחות, אך לא יותר מ-24 שעות. לאחר מכן מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר כדי לקבוע את צפיפות התא. הכן את מאגר העבודה לדגימות על ידי דילול תמיסת המאגר העובד פי 2 ביחס של אחד לשניים עם מים נטולי יונים בבקבוקון של 1.7 מיליליטר. הוסף את הנפח המתאים של תרבית שמרים הנדרש לשחזור שני מיליון תאי שמרים לבקבוקון של 1.7 מיליליטר עבור כל דגימה. צנטריפוגה של הבקבוקון למשך דקה אחת ב-4500 גרם, ובעזרת מיקרו פיפטה, הסר בזהירות והשליך את הסופרנטנט כפסולת מסוכנת ביולוגית. השעו מחדש את התאים הגלולים במיליליטר אחד של PBSA לפני שתחזרו על הצנטריפוגה והסרת הסופרנטנט. תשאיר את זה בצד. הכן את תמיסת ה-SHP-2 האנושית הרקומביננטית בריכוז סופי של 1,000 ננומול בנפח תגובה כולל של 20 מיקרוליטר. לאחר מכן, הוסף 7.7 מיליגרם של DTT ל-10 מיליליטר של מים נטולי יונים בצינור חרוטי של 15 מיליליטר כדי ליצור תמיסת DTT של חמישה מילי-מולריות. כעת, קח את התאים הגלולים והשהה אותם מחדש במאגר העבודה כך שנפח התגובה הסופי יהיה 20 מיקרוליטר לדגימה. הוסף שני מיקרוליטר של תמיסת DTT של חמישה מילי-מולרית לכל דגימה לריכוז DTT סופי של 0.5 מילימולר. הוסף את הנפח המוכן של SHP-2 לכל דגימה כדי להשיג נפח סופי של 20 מיקרוליטר, וערבב בעדינות באמצעות מיקרו פיפטה. עטפו את מכסי בקבוקון הדגימה עם Parafilm כדי למנוע דליפה או זיהום צולב. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים על רוטור במהירות קבועה. לאחר הוצאת הדגימות מהרוטור, עצור את התגובה על ידי הוספת מיליליטר אחד של PBSA לכל דגימה לפני צנטריפוגה שוב למשך דקה אחת. ואז השליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את הדגימות הגלוליות בתערובת של 20 מיקרוליטר של הריאגנטים העיקריים המתאימים להן, ודגרו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 20 דקות, דגימות צנטריפוגות ב-4500G למשך דקה אחת והשליכו את הסופרנטנט כפסולת ביולוגית מסוכנת. שטפו את התאים פעם אחת על ידי השעיה מחדש במיליליטר אחד של PBSA לפני צנטריפוגה נוספת של התאים. כעת, השעו מחדש את הדגימות בתערובת של 20 מיקרוליטר של הריאגנטים המשניים המתאימים להם, ודגרו למשך 15 דקות בחושך. לאחר צנטריפוגה של הדגימות והשלכת הסופרנטנט, שטפו את התאים פעם נוספת עם PBSA לפני שצנטריפוגים אותם שוב. לאחר מכן, השעו מחדש את הדגימות השטופות ב-300 עד 500 מיקרוליטר של PBSA, והעבירו אותן לצינורות פוליסטירן של חמישה מיליליטר לניתוח ציטומטריית זרימה. לאחר הכנת הציטומטר, לחץ על קובץ, ואחריו על כפתור ניסוי חדש, תן שם לניסוי ולחץ על שמור כדי להבטיח שהנתונים שנרכשו יישמרו בנתיב הקובץ הרצוי. בחר בסמל עלילת הנקודות בסרגל הכלים העליון כדי ליצור שתי עלילות נקודות או יותר עבור כל דגימה. עבור אחת מתרשימי הנקודות, ודא ששם ציר ה- x מציג את ערוץ FSCA, ושם ציר ה- y מציג את ערוץ SSCA. עבור תרשים אחר, בחר את שם ציר ה-x כדי להציג את הערוץ שבו המגיב המשני המכוון לנוגדן תג האנטי-אפיטופ העיקרי זוהר, ואת שם ציר ה-y כדי להציג את הערוץ שבו המגיב המשני של סטרפטווידין זוהר. ספק שם תיאורי לדגימה על ידי לחיצה ימנית על הצינור, בחירה באפשרות ערוך שם והזנת שם המדגם. הנח כל צינור דגימה במחזיק הציטומטר, ולחץ על הפעל כדי להתחיל לטעון את הדגימה ולרכוש נתונים. התאם אירועים, זמן וקצב זרימה לפי הצורך. הגדר שער המקיף את תאי השמרים הבריאים בחלקת SSCA לעומת FSCA. לאחר מכן רשום את הקרינה של כל דגימות הבקרה. הגדר אסטרטגיית שער עבור החלקה שנוצרה לפני ניתוח הדגימות המטופלות. רשום את הקרינה של דגימות דה-זרחניות באמצעות הציטומטר ואסטרטגיית השער לפני ניתוח הנתונים באמצעות תוכנת זרימה ציטומטרית. הערך זרחון על ידי מדידה והשוואה של חציון ציר ה-y של תאים המבטאים חלבון על פני השטח שלהם, והזרחון הבסיסי המסופק על ידי תאים שאינם משחקים בין דגימות לבקרות. לבסוף, חשב את אחוז הפרש הזרחן החציוני באמצעות הנוסחה המסופקת. ההשפעה של ריכוזי פוספטאז SHP-2 משתנים וזמני הדגירה על הפרש הזרחן החציוני במצעים המוצגים על פני השטח של שמרים מודגמת באיור זה. אחוז הפרש הזרחן החציוני ירד עם הזמן בכל ריכוזי SHP-2, כאשר הדפוספורילציה הגבוהה ביותר נצפתה בריכוז SHP-2 ננו-מולרי לאחר ארבע שעות. לאחר שעתיים של דגירה, 1,000 ננו-מולרי SHP-2 הביא להפרש זרחון חציוני של כ-48.8%, נמוך משמעותית מהמצב של 750 ננו-מולרי באותה נקודת זמן. לא נצפה הבדל משמעותי בהבדל החציוני בזרחון כאשר הדגירה הוארכה משעתיים לשלוש שעות על פני ריכוזי SHP-2 של 500 ננו-מולר, 750 ננו-מולרי ו-1,000 ננו-מולרי.