סינתזה של שלפוחיות חד-כיווניות ענקיות: מודל ביומימטי של תאים גרעיניים

מאמר זה מציג שיטה להכנת שלפוחיות ענק חד-תכליתיות (cGUVs) בעלות מבנה שלפוחית בתוך שלפוחית, עם מוליכות חשמלית מותאמת אישית באזורים פנימיים, טבעתיים וחיצוניים. אלקטרופורמציה מסנתזת GUVs פשוטים, שהופכים לסטומטוציטים ו-cGUVs באמצעות הלם אוסמוטי, ומספקים מודל רב ערך לחקר הביופיזיקה של תאים גרעיניים.

ערכנו מחקר מפורט על הסינתזה וההידרודינמיקה האלקטרו-דינמית של שלפוחיות ענק חד-כיווניות כדי לבסס אותן כמקבילות ביו-מגנטיות לתאים אוקריוטיים. הניסיון הוא בהבנת טכנולוגיות הכרוכות ביישום שדה חשמלי על תאים ביולוגיים כגון אלקטרופורציה של תאים ואלקטרו-דפורמציה של תאים.

שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואור, טיפולים חשמליים בפולסים ננו-שניות, אוסצילוסקופ ומקורות כוח ושיטות סינתזה חדשניות משמשים לקידום המחקר בתחום זה. האתגר בסינתזה של GUVs מורכבים מעוצבים היטב ברגישות של שיטה לטמפרטורה, סוגי שומנים והרכב המשמש. בעבודה זו, אנו מדגימים זאת עבור מערכת DMPC וכולסטרול, אך הכללה זו נותרה מאתגרת. GUVs פשוטים המחקים תאי גרעין סונתזו בספרות. אנו מסנתזים את שלפוחית הענק המורכבת כדי לחקות תאים גרעיניים עם מבנה ההגנה של השסתום, הסוגרים שלפוחית פנימית בגודל של כמחצית מגודל השלפוחית החיצונית.

נתמקד בחקר ההשפעה של פולסים מיקרו-וננו-שניות על השלפוחית הפנימית, שהיא חיקוי לגרעין של תא ביולוגי בהקשר של אלקטרופורציה.

[קריין] כדי להתחיל, יש לנקות היטב את תחמוצת פח האינדיום או שקופיות מצופות ITO באמצעות תמיסת סבון כלים, ולשטוף במים נטולי יונים עם מוליכות של 0.055 מיקרוסימנס לסנטימטר. לאחר מכן בעזרת תמיסת אתנול 100%, נקו שוב את המגלשות ושטפו במים נטולי יונים. יבש את השקופיות בתנור המוגדר ל 85 מעלות צלזיוס. זהה את הצד המוליך של כל שקופית מצופה ITO באמצעות clamp מד. אבטח את המגלשה הנקייה על מקודד הסיבובtagה באמצעות ואקום, וודא שהצד המוליך פונה כלפי מעלה. מרחו 25 מיקרוליטר מתמיסת השומנים, אחת היא ארבע טיפות על הצד המוליך של שקופית ITO אחת. קח שקופית נוספת ומרח 25 מיקרוליטר מתמיסת השומנים שתיים באותו אופן. יבש בוואקום את שתי השקופיות המצופות שומנים בחומר ייבוש המאוחסן בחושך למשך שעתיים לפחות. לאחר מכן סדרו שקופית ITO מצופה שומנים עם שומן במקביל לשקופית נקייה, וודאו שהצדדים המוליכים פונים זה לזה, והניחו ביניהם מרווח גומי סיליקון בעובי שלושה מילימטרים. אטום את ההתקנה בעזרת מהדק ליצירת תא אלקטרופורמציה. כעת מלאו את החדר בתמיסת סוכרוז של 100 מילי-מולרית באמצעות מזרק של שני מיליליטר. חבר את כבל הפלט של מחולל הפונקציות לשקופיות המצופות ITO עם מחולל הפונקציות. הנח את שני תאי האלקטרופורמציה בחממה המתוחזקת בין 38 ל -40 מעלות צלזיוס. הפעל שדה חשמלי זרם חילופין של חמישה וולט משיא לשיא בתדר 10 הרץ באמצעות מחולל פונקציות דו-ערוצי למשך ארבע שעות. לאחר הדגירה, נתק את תאי האלקטרופורמציה ממחולל הפונקציות. מוציאים אותם מהחממה ומניחים להם להתקרר לטמפרטורת החדר. בעזרת מזרק, קצרו את שלפוחיות הענק החד-צדדיות המסונתזות מכל תא והעבירו אותן לצינורות מיקרו-צנטריפוגה נפרדים של שני מיליליטר. דגרו את הצינורות בטמפרטורת החדר שבין 25 ל-27 מעלות צלזיוס למשך שעה לפני שתמשיכו להלם אוסמוטי. העבירו 200 מיקרוליטר של שלפוחיות ענק חד-מולריות, או sGUVs, תלויות באמצעי לחות המכיל תמיסת סוכרוז של 100 מילי-מולרית לתוך תא התצפית, והכניסו 125 מיקרוליטר של תמיסת גלוקוז של 300 מילי-מולרית כדי לגרום להלם אוסמוטי וליזום מעברי צורה. אפשרו ל-sGUVs, שעוברים כעת הלם אוסמוטי, לנוח במשך שעה בתוך תא התצפית הממוקם על שלב המיקרוסקופיה. בצע ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות ומיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופ הפוך המצויד במצלמה מונוכרומטית. השתמש בעדשות אובייקטיביות למרחק עבודה ארוך במיוחד של Plan Fluor 20X על 0.45 ו-40X על 0.60 כדי לצפות במעברי צורה ב-sGUVs. עבור אפיפלואורסצנטיות, השתמש בסט מסננים ירוק עם עירור ב-510 עד 560 ננומטר, מראה דיכרואית ב-575 ננומטר ומסנן מחסום ב-590 ננומטר עבור שכבות דו-שכבתיות מוכתמות באדום ניאל. עקוב אחר מעברי צורה בתוך תא התצפית באמצעות ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות ומיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית עם עדשות אובייקטיביות של Plan Fluor. שימו לב להיווצרות שלפוחיות סטומטוציטיות ככל שמעבר הצורה מתקדם. עקוב אחר האופן שבו השלפוחיות הגדולות יותר מתיישבות תחילה, ולאחר מכן עלייה במספר השלפוחיות הקטנות יותר לאורך זמן. לאחר מכן, הוסף תמיסת מלח כדי להתאים את המוליכות באזורים שונים של ה-cGUVs לפני גרימת הלם אוסמוטי. לדוגמא, כדי ליצור מוליכות גבוהה יותר באזורים החיצוניים והפנימיים מאשר האזור הטבעתי, העבירו 200 מיקרוליטר תמיסת סוכרוז לתא האלקטרופוזיה. הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת מלח של 7.5 מילי-מולרית לתוך החדר, וגרם להלם אוסמוטי עם 125 מיקרוליטר של תמיסת גלוקוז של 300 מילי-מולאר. אפשר ל-sGUVs של ההלם האוסמוטי לנוח בתא למשך שלוש עד ארבע שעות. אשר כי ל-cGUVs המתקבלים יש מוליכות גבוהה יותר באזורים החיצוניים והפנימיים בהשוואה לאזור הטבעתי. כדי לבצע אלקטרו-דפורמציה של ה-cGUVs, רווח את אלקטרודות החוט במרחק של 500 מיקרומטר זה מזה, והפעל פוטנציאל חשמלי של זרם חילופין של 7.5 וולט שיא לשיא ב-100 קילו-הרץ באמצעות מחולל פונקציות. לאחר הפעלת השדה החשמלי, צלם וידאו במהירות של 10 פריימים לשנייה, והתבונן בעיוות האובלט של השלפוחיות החיצוניות ובעיוות הפרולאט של השלפוחיות הפנימיות. לאחר מכן טען את תערובת ה-cGUV לתוך שקופית חלל ואטום עם החלקת כיסוי כדי למנוע תנועה. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר כדי לנתח מורפולוגיה של cGUV באמצעות סריקת ציר Z בגודל צעד של מיקרומטר אחד. השתמש בעדשת אובייקטיבית Plan Apochromat 40X על 1.3 שמן DIC להדמיה. השתמש במצב ערוץ יחיד אדום עם עירור של 561 ננומטר ופליטה של 561 עד 695 ננומטר כדי לדמות cGUV מוכתם ב-Niall Red או Rhodamine PE. שנה וחלץ את הקובץ . קובץ תמונה CZI באמצעות התוכנה המקושרת למיקרוסקופ. הוסף גרפיקה כגון סרגלי קנה מידה, והפעל תצוגות דו-ממדיות ותלת-ממדיות. לאחר מכן עבור לשיטת עיבוד ופרמטרים כדי להתאים את ההגדרות הרצויות. לאחר מכן לחץ החל כדי לייצא את התמונה בפורמט JPG. לבסוף, פתח את הקובץ בתוכנת ImageJ. כדי להוסיף סרגל קנה מידה, עבור אל ניתוח, ואחריו הגדר קנה מידה לכיול, ולאחר מכן בחר ניתוח ואחריו כלים וסרגל קנה מידה כדי להחיל אותו. הדמיית מחסנית Z קונפוקלית אישרה כי השלפוחיות הפנימיות הופרדו לחלוטין מהשלפוחיות החיצוניות והוגבהו במישור Z עקב צפיפות נמוכה יותר של התמיסה הפנימית. מצב הסטומטוציטים הבינוני הראה צוואר צר המחבר בין שלפוחיות פנימיות וחיצוניות לפני הפרדה מוחלטת. אוכלוסייה מגוונת של צורות שלפוחית, כולל שלפוחיות פנימיות מרובות, גופים בצורת כוכב ומבנים צינוריים נצפתה שש שעות לאחר הלם אוסמוטי. שפע גבוה של cGUVs נוצר באמצעות תערובת ליפידים של 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine וכולסטרול ביחס של 63 עד 37 מולארי. תחת שדה חשמלי של זרם חילופין, cGUVs הראו דפורמציה כאשר השלפוחית החיצונית יוצרת צורה אובלטית והשלפוחית הפנימית יוצרת צורה פרולאטית.