ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעינים טריגמינליים שלמים

מחקר זה מתמקד ברשתות עצביות של גנגליונים היקפיים, במטרה להבין את האותות והאינטראקציות הבין-תאיות המעורבות בכאב, גירוד ותחושת מגע. נוירונים חשים גירויים, אך חקר פעילותם in vivo בתנאים פיזיולוגיים רגילים נותר מאתגר מאוד. הפרוטוקול שלנו מאפשר לחקור את ההפעלה העצבית של גנגליון טריגמינלי ברמת האוכלוסייה ישירות בתגובה לגירויים, דבר חשוב מבחינה פיזיולוגית, אך מאתגר מאוד מבחינה טכנית.

נתונים המיוצרים על ידי פרוטוקול זה משמשים כהשלמה רבת עוצמה לנתוני התנהגות, תרבית תאים ואימונוהיסטוכימיה, ומאפשרים לחקור את ההשפעות המיידיות של גירויים או תרופות על גנגליון שלם. כדי להתחיל, הניחו את העכבר המורדם על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף על 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן מקמו את הראש במסכה סטריאוטקטית עם הטיה של כ-15 מעלות שמאלה. מרחו משחה עיניים על העיניים למניעת יובש וגירוי.

לאחר גילוח הצד הימני של ראש העכבר, בצע חתך מלבני של תשעה מילימטרים על חמישה מילימטרים בין האוזן הימנית לעין ימין. חותכים את הרקמה על פני הגולגולת ממש גחון לעין. עצור כל דימום באמצעות מטוש המוסטטי או מגבון מעבדה.

בעזרת מקדחה דנטלית ובור סדק מתחדד, קדחו חור בגודל של כתשעה מילימטרים על חמישה מילימטרים בגולגולת הגבית שבמרכזה אתר החתך. הטה את הראש עד שהגנגליון הטריגמינלי נראה בבירור. אם יש דימום על הגנגליון הטריגמינלי, שאפו את הדם או הסירו אותו באמצעות מטוש המוסטטי או מגבון מעבדה.

ודא שהגנגליון הטריגמינלי נראה בבירור מבלי להסיר רקמה קליפת המוח. העבר את החיה וכרית החימום לשלב המיקרוסקופ. לאחר אישור שהעכבר מקבל הרדמה איזופלורן רציפה, מקם את המסגרת הסטריאוטקסית כך שמטרת המיקרוסקופ תהיה תשעה מילימטרים ישירות מעל פתח הגולגולת.

הכנס את מדחום פי הטבעת וחבר את כבל החשמל למדחום ולמשטח החימום. השתמש במטרה פי 5 כדי לאתר את פני השטח של הגנגליון הטריגמינלי באמצעות המיקרוסקופ. כוונן את המטרה ואת חרוט האף כדי לשטח את משטח הגנגליון ולמקסם את שטח הפנים במישור המוקד.

כעת, טען את פרוטוקול הסריקה המהיר של המיקרוסקופ הנתון. סרוק את הגנגליון הטריגמינלי בפרצים קצרים של שישה עד שמונה מחזורים. החל הקרנות אורתוגונליות של הסריקות כדי ליצור סרט, ובדוק את בהירות התמונה והעקביות בין הפריימים.

טען את פרוטוקול הסריקה ברזולוציה גבוהה של המיקרוסקופ וצור תמונה ברזולוציה גבוהה של הגנגליון הטריגמינלי. שוב, טען את פרוטוקול הסריקה המהיר המשמש ליצירת סרט ההקרנה האורתוגונלי והקלט פעילות ספונטנית במשך 80 מחזורים. צרו את הסרט וודאו שהתמונות ברורות ועקביות מספיק לניתוח.

כדי להפעיל גירוי, הגדר את המיקרוסקופ לסרוק במשך 15 עד 20 מחזורים. לגירוי פון פריי המכוון לאזור V2 של הגנגליון הטריגמינלי, החזק את החוט והחל אותו שוב ושוב על האזור המקביל מתחת לעין ומעל הפה מיד לאחר סריקה 5 ועד מיד לאחר סריקה 10. לגירוי אזור V3, החל את החוט שוב ושוב על האזור המקביל ממש מתחת לאוזן במהלך אותו חלון סריקה.

לגירויים קרים וחומים, יש לקרר או לחמם מים מתחת או מעל הטמפרטורה הרצויה. התחל לסרוק, ומיד לאחר סריקה 5, השתמש בפיפטה העברה מפלסטיק כדי להפעיל את הגירוי התרמי על האזור המקביל מתחת לעין ומעל הפה עבור אזור V2, או ממש מתחת לאוזן עבור אזור V3. בסוף הניסוי, יש להזריק 50 מילי-מולרי אשלגן כלורי תת עורי לאזורי V2 או V3, החל ממחזור 6 כדי להפעיל ולזהות את כל הנוירונים המגיבים.

פתח את קובץ ההקרנה האורתוגונלי על ידי גרירה ושחרור שלו לתוכנת הניתוח. בחר את סוג התמונה על ידי לחיצה על תמונה, לאחר מכן הקלד ובחירת צבע RGB. כדי לפתוח את מנהל החזר ההשקעה, לחץ על ניתוח, לאחר מכן על כלים ובחר מנהל החזר ROI.

בחר נוירונים פעילים על ידי ציור החזר ROI באמצעות כלי האליפסה בסרגל הכלים. הוסף כל אזור שנבחר לקובץ ה-ROI על ידי לחיצה על כפתור ההוספה בחלון מנהל ה-ROI. כעת, עבור אל ניתוח, בחר הגדר מדידות וסמן את האפשרות עבור ערך אפור ממוצע.

בחלון מנהל החזר ההשקעה, לחץ על עוד ולאחר מכן בחר Multi-Measure כדי למדוד את העוצמה. כאשר נפתח חלון חדש עם התווית תוצאות, שמור את קובץ ה- CSV על-ידי בחירה בקובץ ולאחר מכן שמור בשם.פתח את קובץ ה- CSV בתוכנת גיליון אלקטרוני ושמור אותו כקובץ גיליון אלקטרוני. חשב את עוצמת הסידן החולפת באמצעות המשוואה הנתונה.

לצורך הניתוח, דגמו באופן אקראי בערך את אותו מספר נוירונים מכל גנגליון כדי להבטיח שגנגליון אחד לא ישתלט על הניתוח. מדדו את קוטר תאי העצב באמצעות כלי הקו בסרגל הכלים כדי לצייר קווים לאורך הקטרים הארוכים והקצרים ביותר של כל תא עצב. לאחר מכן, חשב את הממוצע של המדידות הללו.

הדמיה קונפוקלית של הגנגליון הטריגמינלי אפשרה הדמיה בו-זמנית של למעלה מ-3,000 נוירונים, ולכידת סידן חולף ספונטני ומעורר גירוי על פני אזורי V2 ו-V3. בהיעדר גירוי, תת-קבוצה של נוירונים אלה הציגה מעברי סידן ספונטניים עם פרופילי פעילות מובהקים על פני שישה תאים במעקב נפרד. יישום חום מזיק על אזור הלסת העליונה הביא להפעלה נראית לעין של נוירונים מרובים, כפי שמצוין על ידי פלואורסצנציה בהירה עם עליות מסונכרנות בעוצמת הסידן החולפת.

חום מזיק המופעל על אזור הלסת התחתונה הפעיל באופן דומה נוירונים נפרדים עם דפוסים משתנים של תגובות סידן על פני תאים בודדים. מספר גבוה משמעותית של נוירונים הגיבו לגירוי פון פריי של שני גרם בהשוואה ל-0.4 גרם באזור V2. עוצמת הסידן החולפת בתאי עצב בודדים עלתה חזק יותר עם גירוי של שני גרם מאשר עם 0.4 גרם, עם שיא גבוה יותר והתפשטות תגובה רחבה יותר.

עוצמת תגובת הסידן הממוצעת במהלך מסגרת הגירוי הראשונה הייתה גם גדולה משמעותית לאחר גירוי של שני גרם בהשוואה ל-0.4 גרם.