מודל עכבר של מחלת כבד סטאטוטית הקשורה להפרעות בתפקוד מטבולי עם פיברוזיס

במחקרינו, אנו מתמקדים במחלת כבד סטאטית הקשורה לתפקוד מטבולי לקוי (MASLD), ובמיוחד במנגנוני הצטברות ליפידים ופיברוזיס. חלק מהפיתוחים האחרונים הם טרנסקריפטומיקה חד-תאית ומיוחדת, תקנון מודלים בעלי חיים של MASLD, ואישור סמגלוטיד לטיפול ב-MASLD. ישנם מודלים רבים של MASLD בבעלי חיים, אך גילינו שרבים מהם לא גרמו לפיברוזיס בכבד.

אז, כדי להתמודד עם הנקודה הזו, פיתחנו את מודל העכבר שלנו של MASLD. מודל העכבר שלנו גורם ל-MASLD עם פיברוזיס על ידי האכלת עכברים היפרפגיים בתזונה הדומה לתזונה האמריקאית הממוצעת. זה גורם ל-MASLD הדומה מאוד למחלה בבני אדם.

השיטה שלנו תסייע במחקרים על פתופיזיולוגיה של MASLD ובדיקת טיפולים חדשים. כדי להתחיל, קבל חתך רקמת כבד מוטמעת בפרפין על שקופית. לפירוק פרפיניזציה, טבלו את הסלייד בקסילן או ציטריסלוב למשך חמש עד חמש עשרה דקות.

לאחר מכן הרטיב מחדש את החלק בסדרה ב-100%, 95 ו-70% אתנול, ואחר כך מים מזוקקים במשך חמש דקות בכל אחד. אחר כך צבע את החלק בסיריוס רד והתייבש את המחסנית. הוציאו שקופית אחת בכל פעם מהתמיסת הניקוי ומרחו אותה על מגבת נייר כדי להסיר נוזלים עודפים.

הוסיפו כ-50 עד 100 מיקרוליטר של מדיום התקנה למקטע. כסו את החלק בכיסוי ולחצו בעדינות כדי להסיר בועות אוויר. תן למחסנית להתייבש באוויר.

כעת, התבוננו במקטע המוכן תחת מיקרוסקופ אור עם תאורה בשדה בהיר באמצעות אובייקטים של 4x עד 20x. העבר כ-500 עד 1000 מיקרוליטר של כבד הומוגנט לצינורות צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר, והוסף חומצה טריכלורואצטית כדי להגיע לריכוז סופי של 12%, מערבב את הצינור לזמן קצר כדי לערבב את התכולה. דגרו את הצינור באמבט מים קרים למשך 30 דקות, וצנטריפוגות אותו בטמפרטורה של 6,000 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר מכן הסר את הסופרנטנט עם פיפטה. הוסיפו מיליליטר אחד של אתנול קר 100% קרח כדי לשטוף את הכדור וסוניקוניקציה כדי להחזיר אותו למושך היטב. לאחר צנטריפוגה נוספת של המתלים, שאיפו את הסופרנטנט.

לאחר הכביסה השלישית, השאר את הצינור פתוח כדי לייבש את הכדור באוויר למשך 10 דקות או יותר לפי הצורך. לאחר מכן הוסף 800 מיקרוליטר של 6 חומצה כלורית רגילה לצינור המכיל את כדור החלבון, ותשהה את הכדור באמצעות סוניקטור כפי שהודגם קודם. העבר את המתלה לצינור זכוכית או בקבוקון עם מכסה ברגים ואטום היטב את הפקק.

דגרו את הצינור בתנור בטמפרטורה של 110 מעלות צלזיוס למשך כ-22 שעות. במידת הצורך, העבר את התכולה מבקבוקון הזכוכית לצינור צנטריפוגה לפני הסיבוב. צנטריפוגה את הדגימה ההידרוליזציה ב-16,000 גרם למשך 10 דקות ושאיפת הסופרנטנט המכיל הידרוקסיפרולין לצינור בנפח 1.5 מיליליטר.

לחמצון הידרוקסיפרולין, הוסף 450 מיקרוליטר של תמיסת כלורמין לצינורות עם 50 מיקרוליטר של דגימה ותקנים. ערבבו את התוכן בצינורות עם מערבולת, ודגרו אותם בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות. לאחר מכן מוסיפים 500 מיקרוליטר של תגובת ארליך לכל דגימה ותקן.

לאחר הוורטקס, דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות באינקובטור. לאחר הדגירה, ניתן לצינורות להתקרר לטמפרטורת החדר ולהתבונן בצבע הסופי של הדגימות. לבסוף, למדוד את ספיגת הדגימות והתקנים באמצעות ספקטרופוטומטר באורך גל של 550 ננומטר.

צביעת קולגן ברקמת כבד עם פיקרו סיריוס אדום, כאשר נצפתה בהארת שדה בהירה, הראה קולגן אדום עם רקע כתום בהיר או צהוב. הצטברות קולגן התואמת לפיברוזיס נצבעה, כמו גם קולגן בדפנות כלי הדם, בהילום ובקפסולת הכבד. מיקרוסקופיית האור המקוטב חשפה סיבי קולגן דו-שבירים מובחנים על רקע כהה, מה ששיפר את המחשת הפיברוזיס.

כימות אזור הקולגן החיובי בכבד בעכברי אגוטי צהובים שהוזנו עם דיאטה עתירת שומן ופרוקטוז, או HFFD, הראה פיברוזיס גבוה משמעותית בהשוואה לעכברי ביקורת מסוג בר שקיבלו תזונה דלת שומן ופרוקטוז. כימותי תכולת הידרוקסיפרולין בכבד הראה רמה גבוהה משמעותית בעכברי אגוטי צהובים שאכלו בתזונת HFFD לעומת עכברי הביקורת לאחר 16 שבועות בדיאטה, מה שמאשר עלייה בהצטברות קולגן בכבד פיברוטיים.