בידוד והערכה ציטומטרית של זרימה של אינטראקציות נוירואימוניות במודל עכברי מיני שבץ
20 ביוני 2025
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת תפקוד תאי החיסון לאחר שבץ איסכמי באמצעות ניתוח זרימה ציטומטרי במודל מיני שבץ. שיטה זו מאפשרת בחינה מפורטת של אינטראקציות נוירואימוניות וניתן להתאים אותה לחקר מחלות ניווניות אחרות, מה שמשפר את ההבנה שלנו לגבי תגובות חיסוניות בפתולוגיה של שבץ מוחי.
היקף המחקר שלנו מתמקד בתפקוד תאי מערכת החיסון לאחר שבץ איסכמי. אנו שואפים להבין את חוקי התאים החיסוניים השוהים והחודרים בפתולוגיה של שבץ מוחי. נכון לעכשיו, זרימה ציטומטרית נמצאת בשימוש נרחב להערכת תפקוד תאי החיסון ואינטראקציות בדלקות עצביות.
בנוסף, טכניקות אימונוניות ותא בודד וריצוף מקדמים את המחקר באינטראקציות נוירו-חיסוניות. המעבדה שלנו תתמקד בהמחשת המסלול של אסטרוציטים באינטראקציות נוירו-אימוניות, תרומות אנג'יו לתהליכים נוירו-דלקתיים. כדי להתחיל, קח מזרק של 50 מיליליטר והצמד מחט בגודל 26 לקצהו.
מלאו את המזרק לחלוטין בתמיסת מלח. מקם את העכבר המורדם בכיוון שכיבה על לוח קצף. הארך את הגפיים הקדמיות והגפיים האחוריות ואבטח אותן באמצעות מחטים בגודל 26.
בעזרת מלקחיים משוננים של האגודל, אחוז בעור הבטן ובצע חתך רוחבי כדי לחשוף את הכבד. חותכים משני צידי הצלעות כדי לחשוף את הלב. כעת הכנס את המחט בגודל 26 לחדר השמאלי וחתך את האורקל הימני.
לחץ על בוכנת המזרק כדי לאפשר לדם להתנקז החוצה. המשך בזלוף עד שהדם המתנקז מהאורקל נראה צלול. לאחר עריפת ראשו של העכבר וחילוץ המוח, העבירו אותו למטריצת מוח מפלדת עכבר וחתכו אותו לפרוסות קרנית עוקבות של שני מילימטרים.
הכניסו 500 מיקרוליטר של תערובת אנזימי עיכול לכל באר של צלחת 12 בארות. בעזרת מיקרו מלקחיים מפרידים בעדינות את רקמת האוטם ומעבירים אותה לתערובת אנזימי העיכול. לבסוף, פרקו את הרקמה במספריים עיניים לחתיכות הקטנות ביותר האפשריות ודגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
בעזרת פיפטה AP 1000, שאפו בעדינות והוציאו את התמיסה 10 פעמים כדי לפרק את הרקמה לתאים בודדים. לאחר מכן העבירו את התמיסה דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר. שטפו שוב ושוב גם את צלחת 12 הבאר וגם את מסננת התאים ב-HBSS קר כקרח המכיל סידן ומגנזיום.
כעת צנטריפוגה את תרחיף התאים שנאסף ב-500 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של PBS.
לאחר שחוזרים על תהליך הצנטריפוגה, השעו את הגלולה שוב ב-150 מיקרוליטר PBS והעבירו את המתלה לצלחת תחתונה עגולה של 96 באר. שוב צנטריפוגה ב 500 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, אחזו בחוזקה בצלחת 96 הבאר והפכו אותה במהירות כדי להשליך את הסופרנטנט.
לאחר מכן, יש לדלל את הקרינה של כדאיות התא ביחס של אחד למאה ב-PBS ולהשעות מחדש את הגלולה ב-150 מיקרוליטר מתמיסת הצבע המדוללת. דגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תוך הגנה על הצלחת מפני אור. לאחר צנטריפוגה של חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, השליכו את הסופרנטנט.
יש לדלל את קוקטייל הנוגדנים על פני התא במיון תאים פעילים מגנטיים או במאגר מקסימלי ומבלי לשטוף את התאים, להוסיף את קוקטייל הנוגדנים לבארות. יש לדגור במשך 15 עד 20 דקות בחום של ארבע מעלות צלזיוס לפני הצנטריפוגה למשך חמש דקות נוספות. לאחר צנטריפוגה של הצלחת והשלכת הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה ב-150 מיקרוליטר של מאגר מקסימלי.
העבירו את המתלה לצינורות צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר או מבחנות פוליסטירן תחתונות עגולות של חמישה מיליליטר. תכנן לוח ציטומטריית זרימה רב צבעוני בהתאם לתצורת המכשיר בשיטות ידניות או בכלי עיצוב פאנל מקוון. כלול צבע כדאיות תא בפאנל כדי לא לכלול תאים ופסולת שאינם ברי קיימא מהנתונים.
התאם את הגדרות גלאי הפיזור קדימה ופיזור הצד כדי להבטיח שהתאים המעניינים מוצגים כהלכה וניתן לסגור אותם כראוי. כוונן את פרמטרי FSC ו-SSC כדי למנוע לכלוך ורעשים זרים. בתרשים נקודות המציג שטח FSC לעומת גובה, הבחין בין כפולות לתאים בודדים.
השתמש באות השלילי של צבע הכדאיות כדי לבודד תאים ברי קיימא. השווה את בקרת האוטופלואורסצנציה מתאים לא מוכתמים עם בקרות חיוביות של תאים מוכתמים כדי לאשר שהתאים המוכתמים מותאמים כראוי לכל פרמטר. כוונן את הפיצוי על ידי ניתוח דגימות תאים צבעוניות ובחינת שתי עלילות נקודות צבע.
כוונן את הגדרות הפיצוי כלפי מעלה או כלפי מטה עד שאוכלוסיות התאים יתיישרו אנכית או אופקית זו עם זו. השתמש באותות CD45 ו-CD11B כדי להבחין בין לימפוציטים, מיקרוגליה, תאים מיאלואידים ואסטרוציטים על סמך דפוסי הביטוי הספציפיים שלהם. השתמש ברקמת מוח דמה כבקרת אוטופלואורסצנטית כדי לשמש כהתייחסות לזיהוי לימפוציטים.
אם מנתחים מטרה ספציפית, השתמשו בבקרת FMO עם רקמת מוח לאחר שבץ מוחי. אסוף את נתוני הבקרה ושמור אותם. באופן דומה, אסוף את הנתונים לדוגמה ושמור אותם.
בחר ומיין את אוכלוסיות תאי היעד למבחנות פוליסטירן תחתונות עגולות של חמישה מיליליטר או צינורות צנטריפוגה חרוטיים של 15 מיליליטר. הוסף 500 מיקרוליטר PBS ושטוף את צינור האיסוף כדי לשמור על כדאיות התאים ולסייע ביצירת גלולות. מיקרוגליה חיובית ל-CCR7 ו-CD11c חיובית כומתו בימים השני והשביעי לאחר שבץ איסכמי.
ביטוי CCR7 במיקרוגליה עלה בחדות ביום השני ונותר גבוה ביום השביעי בהשוואה לביקורת מזויפת. מיקרוגליה חיובית ל-CD11c עקבה אחר מגמה דומה, הגיעה לשיאה ביום השני ונשארה גבוהה יותר ממזויפת ביום השביעי. תרשימי נקודות הראו אותות CCR7 ו-CD11c צפופים בימים השני והשביעי.
בניגוד לאותות דלילים בבקרות דמה. אסטרטגיית שער הפרידה בין תאי מיקרוגליה מיאלואידים ולימפוציטים באמצעות ביטוי CD11B ו-CD45. סמנים נוספים הגדירו תאים ברי קיימא, אסטרוציטים ותת-קבוצות לימפוציטים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול להערכת תפקוד תאי מערכת החיסון לאחר שבץ מוחי איסכמי באמצעות ניתוח ציטומטרי זורם במודל של שבץ מוחי מיניאטורי (mini-stroke). השיטה מאפשרת בחינה מפורטת של אינטראקציות נוירו-אימוניות וניתן להתאימה למחקר של מחלות נוירודגנרטיביות שונות, ובכך היא תורמת להבנת התגובות החיסוניות בפתולוגיה של שבץ מוחי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- פתולוגיה של שבץ מוחי
רקע
- הבנת התגובות החיסוניות בשבץ איסכמי היא קריטית לפיתוח טיפולים.
- אינטראקציות נוירו-אימוניות הן גורם מפתח המשפיע על תוצאות השבץ.
- במודלים קיימים חסרות לעיתים קרובות יכולות ניתוח מפורטות של תפקודי מערכת החיסון.
- מחקר זה נועד לגשר על פער זה באמצעות שימוש בציטומטריה של זרימה.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול להערכת תפקוד תאי מערכת החיסון לאחר שבץ מוחי איסכמי.
- בחינה של אינטראקציות נוירו-אימונולוגיות במודל של מיני-שבץ (mini-stroke).
- העמקת ההבנה של תגובות חיסוניות במחלות נוירודגנרטיביות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- נעשה שימוש בניתוח Flow cytometry, שאפשר בחינה מפורטת של תפקודי תאי חיסון.
- הופעל מודל של אירוע מוחי קטן (mini-stroke) כדי לדמות תנאים איסכמיים.
- בטקסט לא הוזכרו תהליכי עבודה של multiomics או ניתוח מטבולי.
- לא סופקו שלבי פרוצדורה מפורטים הרלוונטיים לפרוטוקול.
- הודגשה יכולת ההתאמה של השיטה למגוון מחלות נוירודגנרטיביות.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מאפשר הערכה מפורטת של תגובות תאי מערכת החיסון בעקבות שבץ איסכמי.
- הממצאים מספקים תובנות משמעותיות לגבי אינטראקציות נוירו-אימונולוגיות במהלך שבץ.
- היכולת להתאים את השיטה למחלות נוירודגנרטיביות אחרות היא תובנה מרכזית.
- המסקנות מחזקות את החשיבות של הבנת הדינמיקה החיסונית בפתולוגיה של שבץ.
מסקנות
- מחקר זה מדגים מתודולוגיה חסונה לניתוח תגובות חיסוניות בשבץ מוחי.
- הגישה מקדמת את ההבנה של מנגנונים חיסוניים הרלוונטיים לניורודגנרציה.
- לממצאים יש השלכות על פיתוח טיפולים ממוקדים בניהול שבץ מוחי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכה כמותית באמצעות ציטומטריית זרימה של אינטראקציות נוירו-אימוניות במודל עכברים לשבץ מוחי זעיר מאפשרת אפיון מדויק של הפעלה וחדירה של תאי מערכת החיסון בעקבות פגיעה איסכמית. גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים ובתיקוף מטרות עבור פתולוגיות המונעות על ידי נוירו-דלקת, ובכך מספקת מידע לקבלת החלטות בשלבים מוקדמים של תיקי פיתוח עבור מחלות נוירודגנרטיביות ומחלות בכלי הדם המוחיים. יכולת ההתאמה של הפרוטוקול למודלים שונים של מחלות משפרת את הרצף התרגומי ואת רמת הוודאות החזוית עבור אסטרטגיות טיפוליות של ויסות חיסוני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקר של מנגנונים נוירו-אימונולוגיים העומדים בבסיס פגיעה איסכמית וניוון עצבי.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות כימות מצבי הפעלה של תאי מערכת החיסון לאחר שבץ.
- מסייע בהסרת סיכונים מנגנונית עבור מטרות אימונו-מודולטוריות בהפרעות של מערכת העצבים המרכזית (CNS).
- מספק נתונים לביסוס ביטחון חיזוי ותיעדוף של נכסים בשלבים מוקדמים.
סקר ופיתוח בדיקה (Assay)
- מקיים סבבי עבודה מאושרים להכנת סספנסיות של תאים בודדים ולסימון נוגדים לצורך ביצוע פרופיל חיסוני הדיר שחזור.
- מספק קריאות כמותיות ומולטי-פרמטריות המתאימות לסטנדרטיזציה של בדיקות ולסריקה בהמשך התהליך.
- מאפשר פנוטיפוּס של תאי מערכת החיסון באופן ניתן להרחבה (scalable) לצורך הערכת תרכובות בהקשרים של דלקת נוירונלית.
- תומכת בשימוש חוזר בפלטפורמה על פני מודלים של מחלות נוירודגנרטיביות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם בין פרופיל תאי מערכת החיסון לבין נקודות קצה רלוונטיות למחלה במודלים פרה-קליניים של שבץ וניוון עצבי.
- מאפשר רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות נוירו-אימונולוגיות.
- תומך בקבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים בהתבסס על מדדי הפעלה וחדירה של תאי מערכת החיסון.
- מסייע בזיהוי ביומרקרים תרגומיים לתהליכים של דלקת נוירוגנית.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
פרוטוקול זה משתלב ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ותומך בתיקוף מטרות (target validation), הבהרה של מנגנונים חיסוניים ופיתוח בדיקות כמותיות עבור תוכניות מחקר למחלות נוירו-דלקתיות ונוירו-דגנרטיביות.
- ביולוגיה של גילוי: מספקת נתונים חסונים על הפעלה וחדירה של תאי מערכת החיסון לצורך בדיקת היפותזות והבהרת מסלולים.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים הניתנים לשחזור של פרופיל חיסוני לצורך מוכנות של בדיקות וסריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של אוכלוסיות תאי מערכת החיסון בין תנאים ניסיוניים ונקודות זמן שונות.
- מחקר תרגומי: תומכת בהלימה בין מדדים חיסוניים פרה-קליניים לבין סמנים ביולוגיים רלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה זרימת עבודה סטנדרטית וניתנת להתאמה עבור פרופיל חיסוני במגוון מודלים של מחלות CNS.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות נוירו-אימוניות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פרוטוקולים לבידוד תאי מערכת החיסון ולציטומטריית זרימה לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של go/no-go ובהקצאת הון באמצעות אספקת מדדים כמותיים של הפעלת מערכת החיסון.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים של נכסים למחלות נוירו-דלקתיות ונוירו-דגנרטיביות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בנוירו-אנטומיה, ביולוגיה של תאי מערכת החיסון וניתוח פלואיטומטריה (flow cytometry).
- מחייב גישה למכשירי פלואיטומטריה בעלי פרמטרים גבוהים ולפאנלים מאושרים של נוגדנים.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של עיבוד רקמות ואסטרטגיות גייטינג (gating).
- ניתן להתאמה למודלים שונים של מחלות במערכת העצבים המרכזית (CNS) עם אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור סוג הרקמה וההקשר של המחלה.
- פירוש נתוני פרופיל החיסון עשוי לדרוש בדיקות תפקודיות משלימות.
