Name: בידוד והערכה ציטומטרית של זרימה של אינטראקציות נוירואימוניות במודל עכברי מיני שבץ (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: חקור ניתוח ציטומטרי של זרימה להערכת תפקוד תאי חיסון לאחר שבץ איסכמי במודל מיני-שבץ בעכבר. שיטה זו מאפשרת בחינה מפורטת של אינטראקציות נוירואימוניות ומסייעת להבנת תגובות חיסון במחלות נוירודגנרטיביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Kleindorfer, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2021+Guideline+for+the+prevention+of+stroke+in+patients+with+stroke+and+transient+ischemic+attack%3A+A+guideline+from+the+American+heart+association%2FAmerican+Stroke+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">2021 Guideline for the prevention of stroke in patients with stroke and transient ischemic attack: A guideline from the American heart association/American Stroke Association.</a> Stroke. 52 (7), e364-e467 (2021).</li>
<li>Pu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projected+global+trends+in+ischemic+stroke+incidence%2C+deaths+and+disability-adjusted+life+years+from+2020+to+2030%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Projected global trends in ischemic stroke incidence, deaths and disability-adjusted life years from 2020 to 2030.</a> Stroke. 54 (5), 1330-1339 (2023).</li>
<li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+the+stroke+burden+at+the+global%2C+regional%2C+and+national+levels+up+to+2050+based+on+the+global+burden+of+disease+study+2021%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Projections of the stroke burden at the global, regional, and national levels up to 2050 based on the global burden of disease study 2021.</a> J Am Heart Assoc. 13 (23), e036142(2024).</li>
<li>Ma, Y., Yang, S., He, Q., Zhang, D., Chang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+immune+cells+in+post-stroke+angiogenesis+and+neuronal+remodeling%3A+The+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of immune cells in post-stroke angiogenesis and neuronal remodeling: The known and the unknown.</a> Front Immunol. 12, 784098(2021).</li>
<li>Duan, M., Xu, Y., Li, Y., Feng, H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+brain-peripheral+immune+responses+for+secondary+brain+injury+after+ischemic+and+hemorrhagic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Targeting brain-peripheral immune responses for secondary brain injury after ischemic and hemorrhagic stroke.</a> J Neuroinflammation. 21 (1), 102(2024).</li>
<li>Chen, B. R., Wu, T., Chen, T. H., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmune+interactions+and+their+roles+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Fundam+Res%22%5BJournal%5D)">Neuroimmune interactions and their roles in neurodegenerative diseases.</a> Fundam Res. 4 (2), 251-261 (2024).</li>
<li>Zhang, Z., Lv, M., Zhou, X., Cui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+peripheral+immune+cells+in+the+recovery+of+neurological+function+after+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Roles of peripheral immune cells in the recovery of neurological function after ischemic stroke.</a> Front Cell Neurosci. 16, 1013905(2022).</li>
<li>Garcia-Bonilla, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+brain+and+blood+single-cell+transcriptomics+in+acute+and+subacute+phases+after+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of brain and blood single-cell transcriptomics in acute and subacute phases after experimental stroke.</a> Nat Immunol. 25 (2), 357-370 (2024).</li>
<li>Stevens, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+flow+cytometry+to+evaluate+temporal+changes+in+inflammatory+cells+following+focal+cerebral+ischemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The use of flow cytometry to evaluate temporal changes in inflammatory cells following focal cerebral ischemia in mice.</a> Brain Res. 932 (1-2), 110-119 (2002).</li>
<li>Carson, M. J., Reilly, C. R., Sutcliffe, J. G., Lo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+microglia+resemble+immature+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Mature microglia resemble immature antigen-presenting cells.</a> Glia. 22 (1), 72-85 (1998).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1947-1951 (2006).</li>
<li>De Haas, A. H., Boddeke, H. W., Biber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+expression+of+immunoregulatory+proteins+on+microglia+in+the+healthy+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS.</a> Glia. 56 (8), 888-894 (2008).</li>
<li>Mcdonough, A., Weinstein, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmune+response+in+ischemic+preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Neuroimmune response in ischemic preconditioning.</a> Neurotherapeutics. 13 (4), 748-761 (2016).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+reveals+dynamic+microglial-induced+a1+astrocyte+reactivity+via+c3%2Fc3ar%2FNF-kappab+signaling+after+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis reveals dynamic microglial-induced a1 astrocyte reactivity via c3/c3ar/NF-kappab signaling after ischemic stroke.</a> Mol Neurobiol. 61 (12), 10246-10270 (2024).</li>
<li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+controls%2C+instrument+setup%2C+and+the+determination+of+positivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry. 69A, 1037-1042 (2006).</li>
<li>Siddiqui, S., Livak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+advanced+flow+cytometry%3A+A+practical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of advanced flow cytometry: A practical guide.</a> Methods Mol Biol. 2580, 89-114 (2023).</li>
<li>Sousa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+reveals+distinct+inflammation-induced+microglia+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics reveals distinct inflammation-induced microglia signatures.</a> EMBO Rep. 19 (11), e46171(2018).</li>
<li>Martin, E., El-Behi, M., Fontaine, B., Delarasse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+microglia+and+monocyte-derived+macrophages+from+the+central+nervous+system+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of microglia and monocyte-derived macrophages from the central nervous system by flow cytometry.</a> J Vis Exp. 124, e55781(2017).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia-associated+neuroinflammation+is+a+potential+therapeutic+target+for+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Microglia-associated neuroinflammation is a potential therapeutic target for ischemic stroke.</a> Neural Regen Res. 16 (1), 6-11 (2021).</li>
<li>Mao, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+polarization+in+ischemic+stroke%3A+Complex+mechanisms+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+Med+J+%28Engl%29%22%5BJournal%5D)">Microglia polarization in ischemic stroke: Complex mechanisms and therapeutic interventions.</a> Chin Med J (Engl). 134 (20), 2415-2417 (2021).</li>
<li>Shui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+ischemic+stroke%3A+Pathogenesis+insights+and+therapeutic+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inflamm+Res%22%5BJournal%5D)">Microglia in ischemic stroke: Pathogenesis insights and therapeutic challenges.</a> J Inflamm Res. 17, 3335-3352 (2024).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infiltration+and+persistence+of+lymphocytes+during+late-stage+cerebral+ischemia+in+middle+cerebral+artery+occlusion+and+photothrombotic+stroke+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Infiltration and persistence of lymphocytes during late-stage cerebral ischemia in middle cerebral artery occlusion and photothrombotic stroke models.</a> J Neuroinflammation. 14 (1), 248(2017).</li>
<li>Schulze, J., Gellrich, J., Kirsch, M., Dressel, A., Vogelgesang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system-infiltrating+t+lymphocytes+in+stroke+are+activated+via+their+TCR+%28T-cell+receptor%29+but+lack+CD25+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Central nervous system-infiltrating t lymphocytes in stroke are activated via their TCR (T-cell receptor) but lack CD25 expression.</a> Stroke. 52 (9), 2939-2947 (2021).</li>
<li>Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ischemic+stroke+and+their+application+in+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Des+Devel+Ther%22%5BJournal%5D)">Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research.</a> Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).</li>
<li>Leelatian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+human+tissues+and+solid+tumors+with+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+B+Clin+Cytom%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry.</a> Cytometry B Clin Cytom. 92 (1), 68-78 (2017).</li>
<li>Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+Surface+markers+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: Surface markers and beyond.</a> J Allergy Clin Immunol. 143 (2), 528-537 (2019).</li>
<li>Schmit, T., Klomp, M., Khan, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+flow+cytometry+for+simultaneous+and+multi-parametric+analysis+of+heterogenous+cell+populations+in+basic+and+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The application of flow cytometry for simultaneous and multi-parametric analysis of heterogenous cell populations in basic and clinical research.</a> Methods Mol Biol. 2223, 183-200 (2021).</li>
<li>Dukhinova, M., Kopeikina, E., Ponomarev, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usage+of+multiparameter+flow+cytometry+to+study+microglia+and+macrophage+heterogeneity+in+the+central+nervous+system+during+neuroinflammation+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Usage of multiparameter flow cytometry to study microglia and macrophage heterogeneity in the central nervous system during neuroinflammation and neurodegeneration.</a> Methods Mol Biol. 1745, 167-177 (2018).</li>
<li>Rui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+gasdermin+d+drives+early-stage+T-cell+immunity+and+peripheral+inflammation+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Myeloid gasdermin d drives early-stage T-cell immunity and peripheral inflammation in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Neuroinflammation. 21 (1), 266(2024).</li>
<li>Rauber, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+identifies+changes+in+peripheral+and+intrathecal+lymphocyte+patterns+in+CNS+autoimmune+disorders+and+primary+CNS+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry identifies changes in peripheral and intrathecal lymphocyte patterns in CNS autoimmune disorders and primary CNS malignancies.</a> J Neuroinflammation. 21 (1), 286(2024).</li>
<li>Rayaprolu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+microglial+sorting+coupled+with+quantitative+proteomics+identifies+moesin+as+a+highly-abundant+microglial+protein+with+relevance+to+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric microglial sorting coupled with quantitative proteomics identifies moesin as a highly-abundant microglial protein with relevance to Alzheimer's disease.</a> Mol Neurodegener. 15 (1), 28(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל</td><td>קן&nbsp;</td><td>615601</td><td>חומר מעבדה</td></tr><tr><td>1 ופעמים; PBS</td><td>קורנינג</td><td>21-040-ס"מ</td><td>מגיב</td></tr><tr><td>96 בארות שקוף תחתון עגול מטופל TC מיקרופלייט</td><td>קורנינג</td><td>3799</td><td>חומר מעבדה</td></tr><tr><td>APC נגד עכבר CD19</td><td>ביולג'נד</td><td>152410</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>APC/Cyanine7 נגד עכבר CD45</td><td>ביולג'נד</td><td>103116</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>אברטין (1.25%)</td><td>נאנג'ינג אייביי ביוטכנולוגיה&nbsp;</td><td>M2920</td><td>מגיב</td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>ב.ד.</td><td>642510</td><td>ציוד</td></tr><tr><td>סגול מבריק 421 נגד עכבר CD4</td><td>ביולג'נד</td><td>100437</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>סגול מבריק 605 נגד עכבר / CD11b אנושי</td><td>ביולג'נד</td><td>101237</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>BSA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A1933-1G</td><td>כימי</td></tr><tr><td>קולגנאז IV</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C4-28-100 מ"ג</td><td>אנזים</td></tr><tr><td>דנאס א</td><td>מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד</td><td>M0303L</td><td>אנזים</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>EDS-100G</td><td>כימי</td></tr><tr><td>Falcon 5 מ"ל מבחנות פוליסטירן תחתון עגול</td><td>קורנינג</td><td>352052</td><td>חומר מעבדה</td></tr><tr><td>בז&nbsp; צינורות צנטריפוגה חרוטיים 15 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>352095</td><td>חומר מעבדה</td></tr><tr><td>פלוג'ו V10</td><td>ב.ד.</td><td></td><td>תוכנה</td></tr><tr><td>GLAST (ACSA-1) נוגדן, PE</td><td>מילטני ביוטק</td><td>130-118-344</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>RWD מדעי החיים</td><td>R510-22-10</td><td>מגיב</td></tr><tr><td>PE / Cyanine7 נגד עכבר CD3</td><td>ביולג'נד</td><td>100220</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>PE/Dazzle 594 נגד עכבר NK-1.1</td><td>ביולג'נד</td><td>156518</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>מגיב טריזול</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק בע"מ</td><td>15596026</td><td>מגיב</td></tr><tr><td>מים מזוקקים ללא DNase/RNase UltraPure</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק בע"מ</td><td>10977015</td><td>מגיב</td></tr><tr><td>דבקי רקמות Vetbond</td><td>3 דקות</td><td>1469 ס"ב</td><td>חומר מעבדה</td></tr><tr><td>ערכת כדאיות ניתנת לתיקון של Zombie Aqua</td><td>ביולג'נד</td><td>423102</td><td>צבע פלואורסצנטי מגיב אמין</td></tr></tbody></table>

בידוד והערכה ציטומטרית של זרימה של אינטראקציות נוירואימוניות במודל עכברי מיני שבץ

Isolation and Flow Cytometric Assessment of Neuroimmune Interactions in a Mini-Stroke Murine Model

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול מעודן להערכת הפונקציונליות של תאי חיסון לאחר שבץ איסכמי, תוך שימוש בניתוח זרימה ציטומטרי במודל מיני שבץ. המיני שבץ נגרם על ידי קשירה קבועה של הענף הדיסטלי של עורק המוח האמצעי הימני (MCA), ואחריו חסימה של 7 דקות של עורקי הצוואר המשותפים הדו-צדדיים (CCAs). מתודולוגיה זו מניבה שבץ מוחי קל המאופיין בנפחי נגעים קטנים ועקביים ושיעור תמותה נמוך להפליא. יתר על כן, יכולתו של המודל לחקור אינטראקציות נוירואימוניות ארוכות טווח הופכת אותו למתאים במיוחד לבחינת תפקיד הדלקת בתהליך ההחלמה לאחר שבץ מוחי.
...

Stroke is a leading cause of death and long-term disability worldwide, with ischemic stroke representing the majority of cases. Following an ischemic ...

היקף המחקר שלנו מתמקד בתפקוד תאי מערכת החיסון לאחר שבץ איסכמי. אנו שואפים להבין את חוקי התאים החיסוניים השוהים והחודרים בפתולוגיה של שבץ מוחי. נכון לעכשיו, זרימה ציטומטרית נמצאת בשימוש נרחב להערכת תפקוד תאי החיסון ואינטראקציות בדלקות עצביות.בנוסף, טכניקות אימונוניות ותא בודד וריצוף מקדמים את המחקר באינטראקציות נוירו-חיסוניות. המעבדה שלנו תתמקד בהמחשת המסלול של אסטרוציטים באינטראקציות נוירו-אימוניות, תרומות אנג'יו לתהליכים נוירו-דלקתיים. כדי להתחיל, קח מזרק של 50 מיליליטר והצמד מחט בגודל 26 לקצהו.מלאו את המזרק לחלוטין בתמיסת מלח. מקם את העכבר המורדם בכיוון שכיבה על לוח קצף. הארך את הגפיים הקדמיות והגפיים האחוריות ואבטח אותן באמצעות מחטים בגודל 26.בעזרת מלקחיים משוננים של האגודל, אחוז בעור הבטן ובצע חתך רוחבי כדי לחשוף את הכבד. חותכים משני צידי הצלעות כדי לחשוף את הלב. כעת הכנס את המחט בגודל 26 לחדר השמאלי וחתך את האורקל הימני.לחץ על בוכנת המזרק כדי לאפשר לדם להתנקז החוצה. המשך בזלוף עד שהדם המתנקז מהאורקל נראה צלול. לאחר עריפת ראשו של העכבר וחילוץ המוח, העבירו אותו למטריצת מוח מפלדת עכבר וחתכו אותו לפרוסות קרנית עוקבות של שני מילימטרים.הכניסו 500 מיקרוליטר של תערובת אנזימי עיכול לכל באר של צלחת 12 בארות. בעזרת מיקרו מלקחיים מפרידים בעדינות את רקמת האוטם ומעבירים אותה לתערובת אנזימי העיכול. לבסוף, פרקו את הרקמה במספריים עיניים לחתיכות הקטנות ביותר האפשריות ודגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.בעזרת פיפטה AP 1000, שאפו בעדינות והוציאו את התמיסה 10 פעמים כדי לפרק את הרקמה לתאים בודדים. לאחר מכן העבירו את התמיסה דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר. שטפו שוב ושוב גם את צלחת 12 הבאר וגם את מסננת התאים ב-HBSS קר כקרח המכיל סידן ומגנזיום.כעת צנטריפוגה את תרחיף התאים שנאסף ב-500 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של PBS.לאחר שחוזרים על תהליך הצנטריפוגה, השעו את הגלולה שוב ב-150 מיקרוליטר PBS והעבירו את המתלה לצלחת תחתונה עגולה של 96 באר. שוב צנטריפוגה ב 500 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, אחזו בחוזקה בצלחת 96 הבאר והפכו אותה במהירות כדי להשליך את הסופרנטנט.לאחר מכן, יש לדלל את הקרינה של כדאיות התא ביחס של אחד למאה ב-PBS ולהשעות מחדש את הגלולה ב-150 מיקרוליטר מתמיסת הצבע המדוללת. דגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תוך הגנה על הצלחת מפני אור. לאחר צנטריפוגה של חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, השליכו את הסופרנטנט.יש לדלל את קוקטייל הנוגדנים על פני התא במיון תאים פעילים מגנטיים או במאגר מקסימלי ומבלי לשטוף את התאים, להוסיף את קוקטייל הנוגדנים לבארות. יש לדגור במשך 15 עד 20 דקות בחום של ארבע מעלות צלזיוס לפני הצנטריפוגה למשך חמש דקות נוספות. לאחר צנטריפוגה של הצלחת והשלכת הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה ב-150 מיקרוליטר של מאגר מקסימלי.העבירו את המתלה לצינורות צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר או מבחנות פוליסטירן תחתונות עגולות של חמישה מיליליטר. תכנן לוח ציטומטריית זרימה רב צבעוני בהתאם לתצורת המכשיר בשיטות ידניות או בכלי עיצוב פאנל מקוון. כלול צבע כדאיות תא בפאנל כדי לא לכלול תאים ופסולת שאינם ברי קיימא מהנתונים.התאם את הגדרות גלאי הפיזור קדימה ופיזור הצד כדי להבטיח שהתאים המעניינים מוצגים כהלכה וניתן לסגור אותם כראוי. כוונן את פרמטרי FSC ו-SSC כדי למנוע לכלוך ורעשים זרים. בתרשים נקודות המציג שטח FSC לעומת גובה, הבחין בין כפולות לתאים בודדים.השתמש באות השלילי של צבע הכדאיות כדי לבודד תאים ברי קיימא. השווה את בקרת האוטופלואורסצנציה מתאים לא מוכתמים עם בקרות חיוביות של תאים מוכתמים כדי לאשר שהתאים המוכתמים מותאמים כראוי לכל פרמטר. כוונן את הפיצוי על ידי ניתוח דגימות תאים צבעוניות ובחינת שתי עלילות נקודות צבע.כוונן את הגדרות הפיצוי כלפי מעלה או כלפי מטה עד שאוכלוסיות התאים יתיישרו אנכית או אופקית זו עם זו. השתמש באותות CD45 ו-CD11B כדי להבחין בין לימפוציטים, מיקרוגליה, תאים מיאלואידים ואסטרוציטים על סמך דפוסי הביטוי הספציפיים שלהם. השתמש ברקמת מוח דמה כבקרת אוטופלואורסצנטית כדי לשמש כהתייחסות לזיהוי לימפוציטים.אם מנתחים מטרה ספציפית, השתמשו בבקרת FMO עם רקמת מוח לאחר שבץ מוחי. אסוף את נתוני הבקרה ושמור אותם. באופן דומה, אסוף את הנתונים לדוגמה ושמור אותם.בחר ומיין את אוכלוסיות תאי היעד למבחנות פוליסטירן תחתונות עגולות של חמישה מיליליטר או צינורות צנטריפוגה חרוטיים של 15 מיליליטר. הוסף 500 מיקרוליטר PBS ושטוף את צינור האיסוף כדי לשמור על כדאיות התאים ולסייע ביצירת גלולות. מיקרוגליה חיובית ל-CCR7 ו-CD11c חיובית כומתו בימים השני והשביעי לאחר שבץ איסכמי.ביטוי CCR7 במיקרוגליה עלה בחדות ביום השני ונותר גבוה ביום השביעי בהשוואה לביקורת מזויפת. מיקרוגליה חיובית ל-CD11c עקבה אחר מגמה דומה, הגיעה לשיאה ביום השני ונשארה גבוהה יותר ממזויפת ביום השביעי. תרשימי נקודות הראו אותות CCR7 ו-CD11c צפופים בימים השני והשביעי.בניגוד לאותות דלילים בבקרות דמה. אסטרטגיית שער הפרידה בין תאי מיקרוגליה מיאלואידים ולימפוציטים באמצעות ביטוי CD11B ו-CD45. סמנים נוספים הגדירו תאים ברי קיימא, אסטרוציטים ותת-קבוצות לימפוציטים.

isolation-flow-cytometric-assessment-neuroimmune-interactions-mini

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פילמנטיות חסימה של עורק המוח התיכון הוא מודל משותף לחקר שבץ איסכמי בעכברים.

דוגמנות שבץ בעכברים - העורקים התיכון ספיגה מוחין עם דגם נימה

מודלים עכבריים שונים של חסימת עורק המוח אמצעית (MCAO) נמצאים בשימוש נרחב בחקר המוח ניסיוני. הנה, אנחנו מדגימים את המודל של MCAO דיסטלי הקבוע transcranial אשר מייצר אוטם קליפת המוח עקבי של גודל המתאים לנזק שהוטל על ידי הרוב המכריע של מקרי שבץ איסכמי אנושיים.

דוגמנות שבץ בעכברים: קרישה קבועה של עורקי דיסטלי התיכון מוחין

אפיון תאי מיאלואידית מוח לאחר שבץ יכול להתבצע על ידי stereology בשיטת fractionator האופטית, או על ידי ניתוח התזרים cytometric של מוח לויקוציטים השעיות. שניהם טכניקות שימושיות לבצע הבחנה phenotypical מדויקת של תת תא מיאלואידית העיקרי נמצאים במוח איסכמי.

Stereological וcytometry זרימת אפיון תת-אוכלוסיות יקוציט במודלים של חולף או קבוע מוחין איסכמיה

פרוטוקול זה מתאר התניה מוקדמת היפוקסית חוזרת ונשנית, או חשיפות קצרות להיפוקסיה מערכתית המפחיתות את נפחי האוטם והפרעה במחסום הדם-מוח בעקבות חסימה חולפת של עורק המוח האמצעי בעכברים. הוא גם מפרט כימות כפול של נפח האוטם והפרעה במחסום הדם-מוח לאחר שבץ מוחי כדי להעריך את היעילות של הגנה נוירו-וסקולרית.

כימות של הגנת עצבים וכלי דם בעקבות חסימת עורק חוזר חוסר חמצן אכשור קד וחלוף התיכון מוחין של עכברים

כאן אנו מציגים מתודולוגיה לייצור שבץ מוחי מוקדי בחומר לבן של עכברים על ידי הזרקה מקומית של מעכב סינתאז תחמוצת החנקן (eNOS) בלתי הפיך (L-Nio). מוצגות שתי וריאציות סטריאוטקטיות, מעקב עצבי רטרוגרדי ותיוג ודיסקציה של רקמות טריות המרחיבות את היישומים הפוטנציאליים של טכניקה זו.

שבץ בחומר הלבן צדדי דגם Murine של קורטיקליים לחקר ניוון אקסונלית ולבן Matter לנוירוביולוגיה

דלקת ממלאת תפקיד מרכזי בפתוגנזה של שבץ איסכמי. עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שהוא פועל כחרב פיפיות המחמירה פגיעה מוחית מוקדמת, אך גם תורמת לתיקון מאוחר יותר. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאי חיסון מהמוח האיסכמי ואת הפנוטיפ הציטומטרי הזרימה שלהם לאחר מכן.

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

על מנת להבין את פתופיזיולוגיה של שבץ, חשוב להשתמש במודלים אמינים. מאמר זה יתאר את אחד דגמי שבץ הנפוצים ביותר בשימוש בעכברים, כינה את חסימת עורק המוח האמצעי (MCAo) המודל (המכונה גם נימת intraluminal או מודל תפר) עם reperfusion.

גישה ניתוחית עבור העורקים התיכון ספיגה מוחין ושבץ reperfusion מושרה של עכברים

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בציטומטריה של זרימה כדי לזהות את השינויים בהרכב תאי מערכת החיסון, בפרופיל הציטוקינים ובפרופיל הכימוקין בסביבה הריאתית לאחר חסימה חולפת של עורק המוח האמצעי, מודל מוריני של שבץ איסכמי.

אפיון תאי מערכת החיסון ומתווכים פרו-דלקתיים בסביבה הריאתית

מודלים שונים של אומת עורק המוח האמצעי (MCAo) משמשים במחקר שבץ ניסיוני. כאן, מודל שבץ ניסיוני של MCAo חולף דרך העורק הראשי החיצוני (ECA) מתואר, שמטרתו לחקות שבץ אנושי, שבו פקקת המוח מוסרת עקב תמוגה קריש ספונטני או טיפול.

שבץ דוגמנות בעכברים: אומת עורק מוחי אמצעי חולף דרך העורק הראשי החיצוני

כדי לחקור את התגובה החיסונית להפרעות מוחיות, גישה נפוצה אחת היא לנתח שינויים בתאי מערכת החיסון. כאן, שני פרוטוקולים פשוטים ויעילים ניתנים לבידוד תאי מערכת החיסון מרקמת המוח וממח עצם הגולגולת.

בידוד תאי מערכת החיסון מהמוח והגולגולת של עכבר

חקור ניתוח ציטומטרי של זרימה להערכת תפקוד תאי חיסון לאחר שבץ איסכמי במודל מיני-שבץ בעכבר. שיטה זו מאפשרת בחינה מפורטת של אינטראקציות נוירואימוניות ומסייעת להבנת תגובות חיסון במחלות נוירודגנרטיביות.

בידוד והערכה ציטומטרית של זרימה של אינטראקציות נוירואימוניות במודל עכברי מיני שבץ

גלה סרטונים נוספים