ב Vivo הדמיה של פעילות עצבית בזבובים בוגרים של דרוזופילה לא מורדמת

אנו מנסים להבין את הבסיס המולקולרי, התאי והמעגלי של שכחת זיכרון טבעית, במטרה לחשוף כיצד המוח מוחק או מדכא זיכרונות באופן פעיל כדי לשמור על גמישות קוגניטיבית. מחקרים אחרונים הראו ששכחה אינה רק דעיכה פסיבית של זיכרונות, אלא תהליך ביולוגי פעיל מווסת מאוד הדורש דפוסים ספציפיים של פעילות עצבית.

אתגר מרכזי הוא קישור מניפולציות מעגלים ספציפיים לתהליכי זיכרון דינמיים תוך שילוב נתונים קונקטומיים, גנטיים והתנהגותיים בצורה קפדנית וניתנת לפרשנות. עזרנו לבסס ששכחה היא תהליך פעיל המווסת ביולוגית. עבודתנו זיהתה נוירונים דופמינרגיים ספציפיים ומסלולים מולקולריים הנדרשים לשכחה נורמלית במוח הדרוזופילה. הפרוטוקול שלנו מאפשר הדמיה תפקודית בזבובים ללא הרדמה, ומונע השפעות לא רצויות לא ספציפיות של חומרי ההרדמה. אנו משתמשים בגישה זו כדי לחקור את המתאמים העצביים העומדים בבסיס היווצרות זיכרון ושכחת זיכרון פעילה.

[קריין] כדי להתחיל, השתמש בכלי Dremel ובלהב מסור יהלום כדי לחתוך צינור מתכת היפודרמי בגודל 22 לאורך של כ-10 סנטימטרים. עם גלגל חיתוך Dremel 420, יש ללטש את שני קצוות הצינור כדי ליצור פתח חלק ונקי שיכול להכיל את החוטם של הזבוב. עטפו את הצינור החתוך סביב צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר ליצירת הצורה המעוקלת הרצויה. לאחר מכן חותכים חתיכה באורך 7 ס"מ של צינורות מתכת היפודרמיים בגודל 12. כעת השתמש בסכין גילוח כדי לקצץ את קצה הפיפטה בנפח 2 מיקרוליטר כך שיתאים לצינורות המתכת בגודל 22. הכנס את הצינור בגודל 12 לקצה השני של קצה הפיפטה. לאחר מכן, מערבבים יחד כמות קטנה של שרף אפוקסי ומקשה. מרחו את האפוקסי על הצמתים שבהם צינור המתכת הקטן פוגש את קצה הפיפטה והיכן שהצינור הגדול יותר מתחבר לקצה השני. הניחו לאפוקסי להתרפא במלואו למשך הלילה לפני חיבור המכלול למחזיק מיקרו מניפולטור והתאמת הזווית לפי הצורך. כדי לבנות פיפטה להעברת זעזועים וריחות, חתוך 1 מיליליטר מפיפטה מזכוכית בגודל 1 x 100 בסימן 3 מיליליטר באמצעות כלי יהלום Dremel. לאחר מכן חותכים יריעת אקריליק מלבנית קטנה בגודל 24.5 מילימטרים על 8 מילימטרים בעובי של 1/8 אינץ '. חותכים רשת זעזועים נחושת כך שתתאים לחתיכת האקריליק המלבנית. הלחמו שני חוטי חשמל לקצוות מנוגדים של רשת הנחושת. כעת הניחו את רשת הנחושת על החלק האקרילי וכופפו אותה מעט כדי להכיל את הבטן והרגליים של הזבוב. השתמש בסרט חשמלי כדי לחבר את רשת הנחושת לחתיכת האקריליק. לאחר מכן השתמש באקדח דבק חם כדי לחבר את פיפטת הזכוכית לרשת ההלם, וודא שהיא ישרה וממורכזת. כדי לבנות את תא ההקלטה, קח שקופית מיקרוסקופ זכוכית כבסיס החדר. מערבבים שרף ודבק אפוקסי יחד. בעזרת דבק האפוקסי, חבר מגנטים ניאודימיום על כל ארבע הפינות של תא אקרילי שחור. הניחו מגנט נוסף על גבי כל מגנט מודבק. לאחר מכן הדביקו את המגנטים החדשים שהוצבו למגלשת זכוכית באמצעות אפוקסי. החזק את המכלול במקומו בעזרת מהדקי נייר בזמן הריפוי. הסר את קצה הפיפטה בנפח 200 מיקרוליטר מהשואב. הכנס את השואב לבקבוקון המכיל את הדרוזופילה ושאף זבוב בודד לקצה הפיפטה של 1,000 מיקרוליטר. החזר את קצה הפיפטה בנפח 200 מיקרוליטר בחזרה על השואב. לאחר מכן נשפו בעדינות והניפו את השואב כך שהזבוב ישותק עם הראש בחלק העליון של קצה הפיפטה בנפח 200 מיקרוליטר. לאחר מכן, הנח את תא הדיסקציה על מחזיק המניפולטור. חבר את הוואקום לצינור החזקת הזבוב והתאם את קצב הזרימה לכ-500 מיליליטר לדקה. כעת העבר את צינור המתכת הוואקום למרכז שדה הראייה של המיקרוסקופ. שאב בעדינות את חוטם הזבובים לתוך מחזיק הוואקום. כוונן את המניפולטור כדי ליישר את ראש הזבוב עם פתח החדר. הפעל את ספק הכוח של הזרם הישר. בעזרת חוט התנגדות פלטינה, מרחו חומצה מיריסטית מומסת כדי להדביק את העיניים ובית החזה לתא. לאחר האבטחה, נתק את צינור הוואקום. הסר את תא ההקלטה מחיבור הוואקום באמצעות המניפולטור והפוך את התא הפוך. לאחר מכן הדביקו את הפרובוסקיס מלמטה באמצעות התנגדות פלטינה. כאשר הכל הודבק, כבה את אספקת החשמל של הזרם הישר. ואז סובב את החדר זקוף. חבר את החדר לבסיס שקופית הזכוכית. חותכים פיסת סרט קטנה במספריים ומניחים אותה מלפנים ומאחורי ראשו של הזבוב. סובב את החדר כך שראשו של הזבוב יפנה אל הנסיין בזווית של 90 מעלות. בעזרת מחט מנתחת, בצע חתכים אנכיים בצידי העיניים. סובב את החדר אופקית. לאחר מכן בצע חתך אופקי על פני הציפורן. כעת הוסיפו 100 מיקרוליטר של מי מלח לחלק העליון של ראש הזבוב. בעזרת מלקחיים חדים, הסר את חלון הציפורן, ולאחר מכן הסר את כל השומן או קנה הנשימה שנותרו בעזרת המלקחיים. הנח זבוב מוכן על שלב המיקרוסקופ של מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בלייזר ומטרת טבילה במים. בעזרת מניפולטור מיקרו, התאם את מיקום רשת ההלם ופיפטת הריח כך שהזבוב ימוקם נכון על רשת ההלם. השתמש בכפתור הכוונון course z כדי לסרוק דרך ציר ה-z של המוח ולאתר את אזור העניין במוח. הגדר את גודל המסגרת ל- 512 x 512 פיקסלים. התחל להקליט מהנוירון המעניין באמצעות מערכת העברת ריחות מותאמת אישית או זמינה מסחרית. הגדר את משך ההקלטה ל-2 דקות. התחל את פרוטוקול האימון באמצעות מערכת אספקת הריחות 5 דקות לאחר איסוף תגובות לפני האימון. לאחר מכן רשום תגובות לאחר האימון כ-5-15 דקות לאחר האימון. אינדיקטור הסידן GCaMP6f והחלבון הפלואורסצנטי האדום tdTomato באו לידי ביטוי באופן סלקטיבי בתא העצב של גוף הפטרייה עם דנדריטים המוקרנים לתוך אונות הגמא והאלפא של גוף הפטרייה, והנוירון הודגם באמצעות קו הנהג MB077C split-GAL4. תגובות הסידן בתא העצב של תפוקת גוף הפטרייה ל-3-אוקטנול הופחתו באופן משמעותי 5 דקות לאחר התניה הפוכה ללא הרדמה ונותרו מדוכאות לאחר 15 דקות. לעומת זאת, תגובות הסידן ל-4-מתיל-ציקלוהקסנול השתפרו באופן משמעותי 5 דקות לאחר האימון ונותרו גבוהות לאחר 15 דקות. תמונות פסאודו-קולור הדגימו שינויים פלואורסצנטיים מובהקים לפני ואחרי האימון. בזבובים מורדמים, תגובות הסידן לאחר האימון ל-CS+ הופחתו רק באופן חלקי והתגובות ל-CS לא היו שונות באופן משמעותי מנקודת ההתחלה. ניתוח כמותי אישר שתגובת CS+ הייתה מדוכאת באופן משמעותי לאחר אימון בזבובים מורדמים, אך תגובות CS נותרו ללא שינוי סטטיסטי. הפלסטיות הייתה גבוהה משמעותית בזבובים לא מורדמים בהשוואה לזבובים מורדמים.