Name: שימוש בשיטת העברת טיפות להכנה אמינה של שלפוחיות יונילמלריות ענקיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-19T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: למדו את שיטת העברת הטיפות להכנת שלפוחיות יונילמלריות ענקיות (GUVs) לביולוגיה סינתטית ומיקרורובוטיקה. פרוטוקול זה מציע יעילות כימוס גבוהה ונגישות למעבדות בסיסיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Träuble, H., Grell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carriers+and+specificity+in+membranes.+IV.+Model+vesicles+and+membranes.+The+formation+of+asymmetrical+spherical+lecithin+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res+Program+Bull%22%5BJournal%5D)">Carriers and specificity in membranes. IV. Model vesicles and membranes. The formation of asymmetrical spherical lecithin vesicles.</a> Neurosci Res Program Bull. 9 (3), 373-380 (1971).</li>
<li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/10.1021/la026100v">Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li>
<li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li>
<li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20336703/">Giant vesicles: preparations and applications.</a> ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).</li>
<li>Ernits, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+production%2C+stability+and+loading+of+synthetic+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Microfluidic production, stability and loading of synthetic giant unilamellar vesicles.</a> Sci Rep. 14 (1), 14071(2024).</li>
<li>Bao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+giant+unilamellar+vesicles+and+encapsulation+of+lyotropic+nematic+liquid+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Production of giant unilamellar vesicles and encapsulation of lyotropic nematic liquid crystals.</a> Soft Matter. 17 (8), 2234-2241 (2021).</li>
<li>Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. <a target="_blank" href="https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2011/sm/c1sm05239j">Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design.</a> Soft Matter. 7 (10), (2011).</li>
<li>Elani, Y., Law, R. V., Ces, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle-based+artificial+cells+as+chemical+microreactors+with+spatially+segregated+reaction+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Vesicle-based artificial cells as chemical microreactors with spatially segregated reaction pathways.</a> Nat Commun. 5 (1), 5305(2014).</li>
<li>Heili, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+exchange+of+protein+and+nucleic+acid+signals+from+and+between+synthetic+minimal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Controlled exchange of protein and nucleic acid signals from and between synthetic minimal cells.</a> Cell Syst. 15 (1), 49-62.e4 (2024).</li>
<li>Shimane, Y., Kuruma, Y. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35464723/">Rapid and facile preparation of giant vesicles by the droplet transfer method for artificial cell construction.</a> Front Bioeng Biotechnol. 10, 873854(2022).</li>
<li>Sato, Y., Hiratsuka, Y., Kawamata, I., Murata, S., Nomura, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micrometer-sized+molecular+robot+changes+its+shape+in+response+to+signal+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Robot%22%5BJournal%5D)">Micrometer-sized molecular robot changes its shape in response to signal molecules.</a> Sci Robot. 2 (4), eaal3735(2017).</li>
<li>De Remigis, E., et al. <a target="_blank" href="https://ieeexplore.ieee.org/document/10768195">Infiltration of cell-inspired ultra-deformable magnetic microrobots in restrictive environments.</a> IEEE Trans Med Robot Bionics. 7 (1), 123-129 (2024).</li>
<li>Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+inverted+emulsion+method+for+high-yield+production+of+biomimetic+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Optimization of the inverted emulsion method for high-yield production of biomimetic giant unilamellar vesicles.</a> ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).</li>
<li>Zhang, Y., Obuchi, H., Toyota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+preparation+and+applications+of+giant+unilamellar+vesicles+formed+via+centrifugation+of+water-in-oil+emulsion+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Membranes%22%5BJournal%5D)">A practical guide to preparation and applications of giant unilamellar vesicles formed via centrifugation of water-in-oil emulsion droplets.</a> Membranes. 13 (4), 440(2023).</li>
<li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.1931005100">Engineering asymmetric vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (19), 10718-10721 (2003).</li>
<li>Palagi, S. <a target="_blank" href="https://github.com/microrobotlab/GUV-dimensional-analysis/tree/v1.0">GUV-dimensional-analysis</a>. , https://github.com/microrobotlab/GUV-dimensional-analysis/tree/v1.0 (2025).</li>
<li>De Remigis, E., et al. Optimisation of encapsulation technique for confining microparticles in lipid membranes. <a target="_blank" href="https://zenodo.org/records/8069820">Zenodo</a>. 2023, DOI: 10.5281/zenodo.8069819 (2023).</li>
<li>Dimova, R., Stano, P., Marques, C. M., Walde, P. <a target="_blank" href="https://www.taylorfrancis.com/chapters/edit/10.1201/9781315152516-1/preparation-methods-giant-unilamellar-vesicles-rumiana-dimova-pasquale-stano-carlos-marques-peter-walde?context=ubx&refId=bca4cc2f-16fd-4222-8c37-3bacb6c1e469">Preparation methods for giant unilamellar vesicles.</a> Giant Vesicle Book. , 3-20 (2019).</li>
<li>Tyler, A. I. I., Greenfield, J. L., Seddon, J. M., Brooks, N. J., Purushothaman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+phase+behavior+of+fatty+acid+containing+membranes+to+membrane+bio-mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Coupling phase behavior of fatty acid containing membranes to membrane bio-mechanics.</a> Front Cell Dev Biol. 7, (2019).</li>
<li>Hamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+vesicles+functionally+expressing+membrane+receptors+for+an+insect+pheromone%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Giant vesicles functionally expressing membrane receptors for an insect pheromone.</a> Chem Commun. 50 (22), 2958(2014).</li>
<li>Roberti, E., Petrocelli, E. L., Cecchi, D., Palagi, S. <a target="_blank" href="https://open-research-europe.ec.europa.eu/articles/5-77">Dimensions, stability, and deformability of DOPC-cholesterol giant unilamellar vesicles formed by droplet transfer.</a> Open Res Eur. 5 (77), (2025).</li>
<li>Weakly, H. M. J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0006349524005666">Several common methods of making vesicles (except an emulsion method) capture intended lipid ratios.</a> Biophys J. 123 (19), 3452-3462 (2024).</li>
<li>Ito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamical+formation+of+lipid+bilayer+vesicles+from+lipid-coated+droplets+across+a+planar+monolayer+at+an+oil%2Fwater+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Dynamical formation of lipid bilayer vesicles from lipid-coated droplets across a planar monolayer at an oil/water interface.</a> Soft Matter. 9 (40), 9539-9547 (2013).</li>
<li>Reis, A., Spickett, C. M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005273612000387">Chemistry of phospholipid oxidation.</a> Biochim Biophys Acta BBA Biomembr. 1818 (10), 2374-2387 (2012).</li>
<li>Storage and handling of lipids. , 
 <a target="_blank" href="https://avantiresearch.com/tech-support/storage-handling-of-lipids">https://avantiresearch.com/tech-support/storage-handling-of-lipids</a> (2025).</li>
<li>Van de Cauter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+cDICE+for+efficient+reconstitution+of+biological+systems+in+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles.</a> ACS Synth Biol. 10 (7), 1690-1702 (2021).</li>
<li>Faizi, H. A., Tsui, A., Dimova, R., Vlahovska, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+rigidity%2C+capacitance%2C+and+shear+viscosity+of+giant+vesicle+membranes+prepared+by+spontaneous+swelling%2C+electroformation%2C+gel-assisted%2C+and+phase+transfer+methods%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Bending rigidity, capacitance, and shear viscosity of giant vesicle membranes prepared by spontaneous swelling, electroformation, gel-assisted, and phase transfer methods: a comparative study.</a> Langmuir. 38 (34), 10548-10557 (2022).</li>
<li>Lehtinen, O. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+temperature%2C+water+content+and+free+fatty+acid+on+reverse+micelle+formation+of+phospholipids+in+vegetable+oil%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Effect of temperature, water content and free fatty acid on reverse micelle formation of phospholipids in vegetable oil.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 160, 355-363 (2017).</li>
<li>Takahashi, H., Ogawa, A. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00173">Preparation of a millimeter-sized supergiant liposome that allows for efficient, eukaryotic cell-free translation in the interior by spontaneous emulsion transfer.</a> ACS Synth Biol. 9 (7), 1608-1614 (2020).</li>
<li>Whittenton, J., Harendra, S., Pitchumani, R., Mohanty, K., Vipulanandan, C., Thevananther, S. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/10.1021/la801133j">Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides.</a> Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).</li>
<li>Hamada, T., Miura, Y., Komatsu, Y., Kishimoto, Y., Vestergaard, M., Takagi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+asymmetric+cell-sized+lipid+vesicles+from+lipid-coated+water-in-oil+microdroplets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Construction of asymmetric cell-sized lipid vesicles from lipid-coated water-in-oil microdroplets.</a> J Phys Chem B. 112 (47), 14678-14681 (2008).</li>
<li>Natsume, Y., Toyota, T. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/chemlett/article-abstract/42/3/295/7389144?redirectedFrom=fulltext&login=true">Giant vesicles containing microspheres with high volume fraction prepared by water-in-oil emulsion centrifugation.</a> Chem Lett. 42 (3), 295-297 (2013).</li>
<li>Hadorn, M., Boenzli, E., Hotz, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analytical+method+to+test+for+salt+effects+on+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A quantitative analytical method to test for salt effects on giant unilamellar vesicles.</a> Sci Rep. 1 (1), 168(2011).</li>
<li>Toparlak, ÖD., et al. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32948587/">Artificial cells drive neural differentiation.</a> Sci Adv. 6 (38), eabb4920(2020).</li>
<li>Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Nishikawa, T., Kazuta, Y., Yomo, T. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24901741/">Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1578-1591 (2014).</li>
<li>Matsushita-Ishiodori, Y., Hanczyc, M. M., Wang, A., Szostak, J. W., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+imaging+flow+cytometry+to+quantify+and+optimize+giant+vesicle+production+by+water-in-oil+emulsion+transfer+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Using imaging flow cytometry to quantify and optimize giant vesicle production by water-in-oil emulsion transfer methods.</a> Langmuir. 35 (6), 2375-2382 (2019).</li>
<li>Caliari, A., Hanczyc, M. M., Imai, M., Xu, J., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+giant+unilamellar+vesicle+fusion+products+by+high-throughput+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantification of giant unilamellar vesicle fusion products by high-throughput image analysis.</a> Int J Mol Sci. 24 (9), 8241(2023).</li>
<li>van Buren, L., Koenderink, G. H., Martinez-Torres, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DisGUVery%3A+a+versatile+open-source+software+for+high-throughput+image+analysis+of+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">DisGUVery: a versatile open-source software for high-throughput image analysis of giant unilamellar vesicles.</a> ACS Synth Biol. 12 (1), 120-135 (2023).</li>
<li>Pazzi, J., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+curvature+promotes+high+yield+spontaneous+formation+of+cell-mimetic+giant+vesicles+on+nanocellulose+paper%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Nanoscale curvature promotes high yield spontaneous formation of cell-mimetic giant vesicles on nanocellulose paper.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 12 (50), 56549-56561 (2020).</li>
<li>Ekosso, C., Liu, H., Glagovich, A., Nguyen, D., Maurer, S., Schrier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerating+the+discovery+of+abiotic+vesicles+with+AI-guided+automated+experimentation%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Accelerating the discovery of abiotic vesicles with AI-guided automated experimentation.</a> Langmuir. 41 (1), 858-867 (2025).</li>
<li>Lee, I. -H., Passaro, S., Ozturk, S., Ureña, J., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intelligent+fluorescence+image+analysis+of+giant+unilamellar+vesicles+using+convolutional+neural+network%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Intelligent fluorescence image analysis of giant unilamellar vesicles using convolutional neural network.</a> BMC Bioinformatics. 23 (1), 48(2022).</li>
</ol>

ביישום טכניקה שתוארה קודם לכן לייצור ליפוזומים1, Pautot et al. הקימו פרוטוקול לייצור שלפוחיות ליפידים בקוטרשנע בין 0.1 ל-1 מיקרומטר בקוטר 2. שיטת העברת הטיפות הוכחה במהירות כיעילה בייצור שלפוחיות גדולות עוד יותר, (קוטר העולה על 1 מיקרומטר)3, וצברה פופולריות הולכת וגוברת בשל פשטות הביצוע ויעילות האנקפסולציה הגבוהה. ואכן, בהשוואה לשיטות נפיחות (כגון נפיחות ג'ל או אלקטרופורמציה), פרוטוקול זה מפחית את נפח תמיסת המטען הנדרשת ליצירת מספר דומה של שלפוחיות והפסולת הנלווית4. ניתן להרכיב GUVs מממשקי נוזלים בשיטות חלופיות עם יעילות אנקפסולציה דומה. עם זאת, בהשוואה לאלה המבוססים על שבבים מיקרופלואידיים 5,6 או אנקפסולציה חוצת ממשק טיפות רציפה (cDICE)7, העברת הטיפות מציעה את ההתקנה הפשוטה ביותר במחיר סביר בכל מעבדה עם ציוד בסיסי. יתר על כן, שיטות מיקרופלואידיות עלולות להוביל ל-GUVs עם תכלילי שמן לא רצויים בממברנה. מסיבות אלה, העברת הטיפות הייתה השיטה המועדפת להעמסת GUVs עם מטענים יקרי ערך בתחומי התאים המלאכותיים 3,8,9,10 ולאחרונה, מיקרו-רובוטיקה 11,12.
השיטה מבוססת על יצירת עלוני ממברנות באמצעות ייצוב ממשקי מים/שמן בתיווך פוספוליפידים. ראשית, פוספוליפידים מומסים בשמן (תמיסת שומנים, LS), ואז מכינים תחליב מים בשמן עם התמיסה המימית המכילה את מטען ה-GUV הרצוי (תמיסה פנימית, IS) ב-LS השומני. לאחר מכן האמולסיה מועברת לצינור שבו תמיסה מימית אחרת (הנקראת תמיסה חיצונית, OS) אוזנה בעבר עם LS ליצירת ממשק מים-שמן. GUVs נוצרים כאשר טיפות מים נאלצות לחצות ממשק OS/LS זה על ידי צנטריפוגה: העלון הפנימי של GUVs נוצר על פני השטח של טיפות IS, בעוד שהעלון החיצוני נוצר בין OS ל-LS (איור 1).
גרסאות פרוטוקול רבות תוארו עם פרמטרים המותאמים בהתאם לצרכי הניסוי המותנים. ניסיון נרחב ראשון לייעל את התהליך תואר על ידי Moga et al.13, בעוד ש-Zhang et al. אספו את רוב הדוגמאות הרלוונטיות בסקירה שנערכה לאחרונה14. למרות הפרמטרים הרבים המתוארים המשפיעים על הפרוטוקול, אין אינדיקציה כיצד ניתן לבצע תהליך אופטימיזציה עבור פורמולציה חדשה של GUV, וגם לא את השיטות המומלצות לשחזור ומניפולציה של GUV לאחר הייצור. בהתבסס על הספרות המדעית הזמינה והניסיון הישיר שלנו, אנו מספקים כאן פרוטוקול כללי לייצור GUVs תוך דיון בעקרונות הבסיסיים. על ידי כך, אנו מספקים אינדיקציות שימושיות לאופטימיזציה של פורמולציות GUV חדשות ושני אמצעי זהירות החלים תמיד על הפרוטוקול: הכנת LS בסביבה מבוקרת ושיטה להסרת שלב השמן העליון בקלות לשחזור דגימת GUV נקייה. בחרנו שתי דוגמאות: האחת עם 240 מ"מ סוכרוז כ-IS ו-0.2 מ"מ DOPC בשמן סיליקון AR20 כ-LS (מצב E [ריק], ראה טבלה 1) והשנייה מורכבת מ-0.2% מיקרו-חלקיקי פוליסטירן 1.1 מיקרומטר ב-240 מ"מ סוכרוז כ-IS ו-3.18 מ"מ DOPC בשמן מינרלי כ-LS (מצב P [עם חלקיקים], ראה טבלה 1). שתי הדגימות הופקו עם 240 מ"מ גלוקוז כ-OS. בחרנו באוסמולריות זו כדי להשיג GUVs שבתנאים פיזיולוגיים יש להם קרום שומני רגוע (מתח ממברנה נמוך).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig1v5.jpg"> 
איור 1: ייצוג סכמטי של שיטת העברת הטיפות. (A) מכינים שלוש תמיסות בבקבוקונים נפרדים: פוספוליפידים בשמן (פאזה צהובה) ליצירת תמיסת שומנים, תמיסה המכילה סוכרוז (בציאן) כתמיסה פנימית, ותמיסת גלוקוז שווה ערך (לבן) כתמיסה חיצונית. (B) לאחר מכן LS מעורבב עם ה-IS ליצירת תחליב יציב, ואז (C) ממשק בין OS ל-LS מותר להתאזן לפני (D) האמולסיה נשפכת עליו. (E) טיפות מים נאלצות לחצות את ממשק LS/OS בכוח צנטריפוגלי כדי (F) לאפשר היווצרות של GUVs. הנתון אינו בקנה מידה ונועד לספק רק סכימה של השיטה. קיצורים: LS = תמיסת שומנים; IS = פתרון פנימי; OS = פתרון חיצוני; GUV = שלפוחית חד-שלמית ענקית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table><tbody><tr><td>0.22 ומיקרו; ממברנת אסטרי תאית מעורבים M&nbsp; מסנני מזרק</td><td>מרק</td><td>SLGSVR255F</td><td></td></tr><tr><td>צינורות 1.5 מ"ל</td><td>מחלקה ביולוגית</td><td>06.0279.00</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; מזרק זכוכית L</td><td>מרק</td><td>20737</td><td></td></tr><tr><td>150 מ"ל</td><td>אוונטור&nbsp;</td><td>213-1123</td><td>לפחות 3</td></tr><tr><td>בקבוקוני זכוכית כהה 20 מ"ל ND24</td><td>אוונטור&nbsp;</td><td>548-9001א</td><td></td></tr><tr><td>צינורות 2 מ"ל</td><td>מחלקה ביולוגית</td><td>07.3534.99</td><td></td></tr><tr><td>צילינדר 50 מ"ל</td><td>אוונטור&nbsp;</td><td>612-3843</td><td></td></tr><tr><td>500 &mu; מזרק זכוכית L</td><td>המילטון</td><td>549-1166</td><td></td></tr><tr><td>שפופרת פלקון 50 מ"ל</td><td>מרק</td><td>CLS352070</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 50 מ"ל&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>8SS50L1</td><td></td></tr><tr><td>צינורות 5 מ"ל</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>622201</td><td></td></tr><tr><td>600 מ"ל</td><td>אוונטור&nbsp;</td><td>213-1126</td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; בקבוק CHNER</td><td>מרק</td><td>Z740682</td><td></td></tr><tr><td>טבעות שעם לצלוחיות תחתונות עגולות</td><td>אוונטור&nbsp;</td><td>217-1000</td><td></td></tr><tr><td>מגבש</td><td>דוצ'ר</td><td>080474א</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-סוכרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>תרמו-היגרומטר דיגיטלי</td><td>בולנדר</td><td>V1863-07</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>מחקר אוונטי</td><td>ברקוד 850375ג</td><td></td></tr><tr><td>מקדחה</td><td>דרמל</td><td>4000</td><td></td></tr><tr><td>מלח דיסודיום אריוגלאוצין (כחול מבריק FCF)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>861146</td><td></td></tr><tr><td>מחט מזרק G18</td><td>טרומו</td><td>AN1838R1</td><td></td></tr><tr><td>מחט מזרק G21</td><td>טרומו</td><td>AN2138R1</td><td></td></tr><tr><td>תא כפפות</td><td>בל-ארט</td><td>F50030-0000</td><td>אם זמין, ניתן להשתמש בתא כפפות, אך במעבדות עם רמות לחות נמוכות יתכן שלא יהיה צורך בכך.</td></tr><tr><td>בוחש מגנטי פלטה חמה</td><td>תוכנת מעבדה LLG</td><td>6.263 448</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי קל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>330779</td><td></td></tr><tr><td>קוצ'יני חדש</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>199737</td><td></td></tr><tr><td>טבעת O טבעת O מגומי ניטריל, קדח 8 מ"מ, קוטר חיצוני 12 מ"מ</td><td>ר.ס.</td><td>196-4863</td><td></td></tr><tr><td>מכסי בורג פתוחים עם מחיצה ND24</td><td>אוונטור&nbsp;</td><td>548-0031א</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופיפטה P1000</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12346132</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופיפטה P10000</td><td>אוונטור&nbsp;</td><td>89079-978</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופיפטה P200</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12326132</td><td></td></tr><tr><td>מגבות נייר</td><td>אוונטור&nbsp;</td><td>KIMB6657</td><td></td></tr><tr><td>פרפילם</td><td>אוונטור&nbsp;</td><td>291-1214</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה (1000)</td><td>אפנדורף</td><td>0030000919</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה (10000)</td><td>אפנדורף</td><td>0030000765</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה (200)</td><td>אפנדורף</td><td>0030000870</td><td></td></tr><tr><td>חלקיקי פוליסטירן, 1.1 ומיקרו; m</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>LB11-1 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>כובע גומי</td><td>ביוקלאס S.r.l.</td><td>12.2300.05</td><td></td></tr><tr><td>אטם חרוטי גומי</td><td>אוונטור&nbsp;</td><td>217-0211</td><td></td></tr><tr><td>מכסי ברגים&nbsp; ND24</td><td>אוונטור&nbsp;</td><td>548-0161א</td><td></td></tr><tr><td>שמן סיליקון AR20</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>10836</td><td></td></tr><tr><td>צינור סיליקון (קוטר פנימי 1.6 מ"מ, קוטר חיצוני 3 מ"מ)</td><td>ר.ס.</td><td>667-8441</td><td></td></tr><tr><td>צינור סיליקון (קוטר פנימי 6 מ"מ, קוטר חיצוני 12 מ"מ)</td><td>ר.ס.</td><td>273-2541</td><td>לפחות 6 מ'</td></tr><tr><td>צומת תלת-כיווני</td><td>ר.ס.</td><td>795-405</td><td></td></tr><tr><td>צומת דו כיווני</td><td>ר.ס.</td><td>419-7287</td><td></td></tr><tr><td>שסתום דו כיווני</td><td>קלבר</td><td>91280</td><td></td></tr><tr><td>מים טהורים במיוחד</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>22934</td><td>כאשר זמין, ניתן להחליף מוצר זה במים מטוהרים באמצעות מערכות Milli-Q</td></tr><tr><td>מספריים אוניברסליים</td><td>בוצ'ם</td><td>4154</td><td></td></tr></tbody></table>

שימוש בשיטת העברת טיפות להכנה אמינה של שלפוחיות יונילמלריות ענקיות

Using the Droplet Transfer Method to Reliably Prepare Giant Unilamellar Vesicles

תכשיר GUV אופטימלי מאופיין בהיווצרות פאזת שמן שקופה וכדור מובהק (איור 4A). במקרים בהם טיפות מים אינן מצליחות להפוך ל-GUVs, הן בדרך כלל קורסות ומשאירות פסולת פוספוליפידים בממשק OS/LS (איור 4C). השפעה זו נגרמת ככל הנראה על ידי הצטברות של פוספוליפידים ומולקולות אחרות משלב השמן, הנובעת משיווי משקל לא מספיק של פוספוליפידים בממשק מים/שמן. עם זאת, למרות היעדר כדור גלוי או נוכחות של פסולת בממשק, GUVs עדיין עשויים להיווצר, מה שמאפשר את המשך התהליך. בעוד ששלבי הכביסה אינם יעילים לחלוטין בהסרת כל פסולת הפוספוליפידים, הם מסייעים באופן משמעותי בסילוק טיפות שמן, ומשפרים את איכות הדגימה הכוללת (השווה איור 6A ואיור 6B).
השימוש ב-LS או LS ישנים שהוכנו בתנאי לחות גבוהה מביא לעתים קרובות להפחתת פיזור GUV עם תפוקה נמוכה יותר ותכולה גבוהה יותר של אגרגטים לא מסודרים שנוצרים ככל הנראה על ידי פוספוליפידים ומולקולות אחרות משלב השמן (איור 6C). עבור LS שהוכן בתנאי לחות גבוהים, ראינו מקדמי שונות מעל 0.8 בייצור GUV (עם דגימות המכילות מעט מאוד GUVs), בעוד שעבור LS שהוכן בתא הכפפות המותאם, מקדם השונות היה מתחת ל-0.5.
תנאי צנטריפוגה שונים עשויים להשפיע על תפוקת ה-GUV ואיכותו. מניתוח איכותני, 20 דקות ב-3,300 × גרם זוהו כמצב טוב עבור GUVs טעוני סוכרוז (דגימה E). הורדת המהירות (45 דקות ב-500 × גרם) הביאה לירידה בתפוקה, בעוד שעלייה (5 דקות ב-16,600 × גרם) הובילה להיווצרות גבוהה יותר של אגרגטים פוספוליפידים לא מסודרים. כוח צנטריפוגלי חלש עשוי למנוע מטיפות רבות לחצות את ממשק OS/LS, ומכאן התפוקה המופחתת, בעוד שכוח חזק עשוי שלא לספק מספיק זמן לארגון הפוספוליפידים על העלון החיצוני במהלך חציית הממשק (איור 7). ניתן לייעל את האנקפסולציה של מיקרו-חלקיקים גם עם התאמות לפרמטרי הצנטריפוגה, בתנאי שצפיפות המסה של המיקרו-חלקיקים תואמת בערך לזו של IS. למטרה זו, הורדת תאוצת הצנטריפוגה (ובתורו הגדלת זמן הצנטריפוגה) מאפשרת אנקפסולציה הומוגנית יותר של חלקיקים, על ידי הימנעות משבירה של הממברנה הפוספוליפידית עקב הכוח שמפעילים החלקיקים המוצקים (דוגמה לאנקפסולציה טובה מוצגת באיור 6D בעוד שהחקירה של פרמטרי צנטריפוגה אופטימליים עדיין נמשכת17).
מכיוון שהדיפוזיה של פוספוליפידים יכולה להיות מושפעת משלב השמן, ניתן להריץ בדיקה איכותית פשוטה כדי להעריך את יציבות האמולסיה (איור 5). בעזרת צבע צביעה (Brilliant Blue FCF) המומס ב-IS כדי לשפר את ההדמיה, ניתן להכין ולצפות באמולסיות עם יחסי מים/שמן שונים לאורך זמן. ניתן לדמיין את אובדן היציבות על ידי הצטברות טיפות מים וכתוצאה מכך הפרדה משלב הנפט. מכיוון שטיפות גדולות (הנראות לעין בלתי) נוטות פחות להיות מומרות ל-GUVs, אנו ממליצים להשתמש בתנאי האמולסיה המספקים את הפרדת הפאזה הנמוכה ביותר.
ניתן לאמת את השפעת הווריאציות בפרוטוקול באמצעות ניתוח התפלגות גודל כמתואר בסעיף פרוטוקול 4: ניתן למדוד את הקוטר של GUVs באמצעות ImageJ מתמונות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה, וניתן לנתח את התפלגות הגודל באמצעות סקריפט זמין ב-GitHub16. בעקבות פרוטוקול זה, היה אפשרי, למשל, לצפות בעלייה ב-GUVs עם קטרים גדולים יותר כאשר שמן מינרלי נבחר על פני שמן סיליקון AR20 (איור 8).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig2v5.jpg"> 
איור 2: הגדרת תא כפפות. איור זה מציג את השינויים העיקריים בתא הכפפות להכנת תמיסת השומנים. (א) חיבור כניסה עם חנקן ואקום; (ב) חיבור כניסה לתא הכפפות; (ג) שסתום יציאה; (ד) מכסה נושא מחטים לאידוי ממס; (ה) צינורות דקים לאידוי ממס; (F) חלקיקי סיליקה לספיגת לחות; (ז) פריטים שיש להציב בתא הכפפות: תרמו-היגרומטר דיגיטלי (1), תמיסת שומנים בממס אורגני (2), מחזיק טבעת שעם (3), מזרק זכוכית (4), מכסה פתוח עם מחיצה ומחטים (5), תמיסת שמן (6), בקבוקון כהה פתוח עם מכסה (7), קצות 10 מ"ל (8), פיפטה P10000 (9); (H) קצה צינור יציאה טבול במים; (I) בקבוקון סגור עם מכסה נושא מחטים המחובר לכניסה ויציאה; (J) סכמות של תא הכפפות המותאם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig3v5.jpg"> 
איור 3: מיכל להסרת שמן קלה. שלבים עיקריים בהכנת GUVs במיכל להסרה קלה של השמן לפי סעיף פרוטוקול 2.1. (א) נקדח חור במכסה צינור של 5 מ"ל כדי לאפשר לקצה P1000 להתאים; ואז (ב) הפקק מונח על צינור ריק של 5 מ"ל כשהקצה מוכנס לחור דרך טבעת O. (C) התמיסות מונחות בצינור לפי סעיפי פרוטוקול 2.2 ו-2.3, הקצה מכוסה, והצינור מונח בתוך צינור של 50 מ"ל. GUVs שהוכנו מ-0.2 mM DOPC בשמן סיליקון הועמסו בסוכרוז של 230.7 mM ו-3.1 mM Brilliant Blue FCF כדי לשפר את ההדמיה. (D) אחרי הצנטריפוגה, שלב השמן העליון נלכד בתוך הקצה יחד עם חלק ממאגר ה-GUV (שנראה ציאן בגלל שחלק מהטיפות לא מצליחות להפוך ל-GUVs ומשחררות את הצבע במערכת ההפעלה). הודות למכסה הגומי, ניתן להסיר בקלות את הקצה מצינור ה-5 מ"ל יחד עם תכולת הנוזל, ובכך לאפשר הסרה מהירה וקלה של כל שלב השמן. (E) ניתן לאסוף בקלות את כדור ה-GUV מתחתית הצינור בפיזור ברור, ללא זיהום שמן נראה לעין, כפי שאומת (F) על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: LS = תמיסת שומנים; IS = פתרון פנימי; OS = פתרון חיצוני; GUV = שלפוחית חד-פעמית ענקית; DOPC = 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig4v5.jpg"> 
איור 4: היווצרות GUV. דוגמאות ל-(A) ממשק OS/LS, (B) כדור GUV נקי עם פאזת שמן שקופה, ו-(C) כדור GUV עם פסולת בממשק OS/LS (הפסולת והגלולה נראים אדמדמים מכיוון שה-IS של אוכלוסיית GUV זו הושלם עם 1.65 מ"מ צבע קוקסין חדש כדי לשפר את ההדמיה). קיצורים: LS = תמיסת שומנים; IS = פתרון פנימי; OS = פתרון חיצוני; GUV = שלפוחית חד-שלמית ענקית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig6v5.jpg"> 
איור 5: יציבות אמולסיה עם יחסי שמן ומים בשמן. האיור מציג את היציבות של תחליבים לאורך זמן, בהתאם לסוג השמן ויחס המים/שמן (w/o) בשימוש. ייצוב התמונה הורכב מ-230.7 מ"מ סוכרוז ו-3.1 מ"מ כחול מבריק FCF כדי לשפר את ההדמיה של האמולסיות. תחליבים שהוכנו עם שמן מינרלי פחות יציבים ממקביליהם העשויים משמן סיליקון AR20. השפעה זו מוגברת עוד יותר עם הגדלת יחסי ה-w/o. למרות שתחליבים בשמן סיליקון AR20 יציבים יותר באופן משמעותי, היציבות שלהם פוחתת גם ככל שיחס ה-w/o עולה, כאשר הפרדת פאזה נראית מיד לאחר האמולסיה (שמן סיליקון AR20 ב-10%). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig5v5.jpg"> 
איור 6: תצפית על GUVs עם מיקרוסקופ ניגודיות-פאזה. הגדלה פי 20 של GUVs טעוני סוכרוז שהוכנו מ-LS המורכב מ-3.18 מ"מ DOPC בשמן מינרלי. (א) דגימה שנמצאה לאחר הסרת השמן; (ב) דגימה שנמצאה לאחר שלבי כביסה; (C) תפוקת GUV ירודה המתקבלת מ-LS שהוכן בסביבות עם חמצן ולחות לא מוסדרים; (D) GUVs טעונים במיקרו-חלקיקים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר; טיפות שמן מוקפות בעיגול, ודוגמאות לאגרגטים לא מסודרים של פוספוליפידים ומולקולות שמן מסומנות על ידי חץ. קיצורים: LS = תמיסת שומנים; GUVs = שלפוחיות חד-כיווניות ענקיות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig7v5.jpg"> 
איור 7: השפעת תנאי צנטריפוגה שונים על היווצרות GUV. תמונות ניגודיות פאזה של GUVs טעוני סוכרוז שהוכנו עם LS המורכב מ-0.2 מ"מ DOPC בשמן סיליקון AR20. האיור מציג השוואה איכותית של GUVs ב-(A) 16,600 × גרם למשך 5 דקות, (B) 3,300 × גרם למשך 20 דקות, ו-(C) 500 × גרם למשך 45 דקות. בעוד שמהירות צנטריפוגה גבוהה מביאה לנוכחות גבוהה יותר של אגרגטים פוספוליפידים, מהירות צנטריפוגה נמוכה מובילה לתשואה מופחתת. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: LS = תמיסת שומנים; GUV = שלפוחית חד-פעמית ענקית; DOPC = 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig8v5.jpg"> 
איור 8: ניתוח התפלגות גודל. השוואה בין שתי דגימות GUV טעונות סוכרוז שהתקבלו מ-(A) 0.2 מ"מ DOPC בשמן מינרלי ו-(B) 0.2 מ"מ DOPC בשמן סיליקון AR20 (*הדגימה דוללה פי 10 כדי לאפשר הבחנה ברורה של GUVs תחת מיקרוסקופ ניגוד פאזה). הניתוח שבוצע בעקבות סעיף 4 של פרוטוקול מראה התפלגות גודל שהועברה לכיוון קטרים גבוהים יותר עבור דגימת השמן המינרלי ביחס לדגימות שמן סיליקון AR20. עם זאת, התשואה של דגימת הסיליקון גבוהה כמעט פי 20. קיצורים: GUV = שלפוחית חד-שלמית ענקית; DOPC = 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>צעד</td>
			<td>מצב E</td>
			<td>תנאי P</td>
			<td>תיאור</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1.1</td>
			<td>4.11 גרם</td>
			<td>17.11 גרם</td>
			<td>מסת סוכרוז</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1.1</td>
			<td>2.16 גרם</td>
			<td>2.16 גרם</td>
			<td>מסת גלוקוז</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1.2</td>
			<td>240 מ"מ</td>
			<td>1000 מ"מ</td>
			<td>ריכוז סוכרוז</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1.2</td>
			<td>240 מ"מ</td>
			<td>240 מ"מ</td>
			<td>ריכוז הגלוקוז</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.3.2</td>
			<td>שמן סיליקון</td>
			<td>שמן מינרלי</td>
			<td>שלב שמן ל-LS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.3.2</td>
			<td>מזרק זכוכית 0.1 מ"ל</td>
			<td>מזרק זכוכית 0.5 מ"ל</td>
			<td>מזרק זכוכית להעברת DOPC בתמיסות כלורופורם</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.3.10</td>
			<td>63 מיקרוליטר</td>
			<td>500 מיקרוליטר</td>
			<td>נפח DOPC בתמיסת כלורופורם</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.3.16</td>
			<td>10 מ"ל</td>
			<td>5 מ"ל</td>
			<td>נפח שמן</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4.1</td>
			<td>3300 גרם 20 דקות</td>
			<td>500 גרם 45 דקות</td>
			<td>מצב צנטריפוגה</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: וריאציות בפרוטוקול. הטבלה מדווחת על וריאציות לשלבים שונים של הפרוטוקול (המצוין בעמודה הראשונה) להכנת שתי אוכלוסיות GUV שונות: GUVs טעוני סוכרוז (מצב E) ו-GUVs טעונים במיקרו-חלקיקים (מצב P).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>מזהה</td>
			<td>השלבים המעורבים</td>
			<td>קוטר פנימי (מ"מ)</td>
			<td>קוטר חיצוני (מ"מ)</td>
			<td>אורך (מ"מ)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>1.2.1; 1.2.3</td>
			<td>7</td>
			<td>13</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>1.2.1; 1.2.4; 1.3.5</td>
			<td>7</td>
			<td>13</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>1.2.1; 1.2.4; 1.3.5</td>
			<td>7</td>
			<td>13</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>1.2.1; 1.2.4; 1.2.5</td>
			<td>7</td>
			<td>13</td>
			<td>2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>1.2.1; 1.2.6; 1.3.13</td>
			<td>7</td>
			<td>13</td>
			<td>2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>1.2.2; 1.2.7; 1.3.11</td>
			<td>3</td>
			<td>7</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>1.2.2; 1.2.7; 1.3.11</td>
			<td>3</td>
			<td>7</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>1.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.15</td>
			<td>3</td>
			<td>7</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>1.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.15</td>
			<td>3</td>
			<td>7</td>
			<td>200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 2: צינורות לחיבורי גז ואקום בתא הכפפות. הטבלה מפרטת את מידות צינורות הסיליקון המשמשים לחיבור תא הכפפות לקווי החנקן והוואקום. מזהי סימוכין מסופקים כדי להקל על תהליך ההרכבה.

Over the past two decades, the droplet transfer method, also known as inverted emulsion, double emulsion, phase transfer, or emulsion transfer, has proven ...

using-droplet-transfer-method-to-reliably-prepare-giant-unilamellar

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

פרוטוקול זה מתאר שיטה שחול להכנת שלפוחית ​​השומנים של מיקרון משנה גדלים עם רמה גבוהה של הומוגניות. שיטה זו משתמשת במערכת לחץ מבוקר עם מבוקרים זרימת שיעורי חנקן להכנת liposome. הכנה שומנים...

שחול קבוע לחץ שבשליטת שיטה להכנת בגודל ננו שלפוחית ​​שומנים

bilayers שומנים נתמך וחלקיקי קרום טבעיים הם מערכות נוחים שיכול להתקרב למאפיינים של קרום תא ולהיות משולבות במגוון רחב של אסטרטגיות אנליטיות. כאן אנו מדגימים שיטה להכנת microarrays המורכב של SiO 2 חרוזים נתמכים שומנים מצופים bilayer, שלפוחית ​​פוספוליפידים או חלקיקי קרום טבעיים.

היווצרות של microarrays Biomembrane עם שיטת הרכבה מבוססת מגב

jetting microfluidic נגד bilayer שומנים ממשק אגל מספק דרך אמינה כדי ליצור שלפוחית ​​עם שליטה על חוסר סימטריה בממברנה, שילוב של חלבונים הטרנסממברני, ואנקפסולציה של חומר. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד מגוון רחב של מערכות ביולוגיות שבי ביומולקולות הממודרת הן רצויה.

השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting

שלפוחיות ענקיות המכילות רכיבים בגודל מיקרומטר ארוזים מאוד הן מודלים שימושיים של תאים. שיטת הצנטריפוגה של תחליב מים בשמן היא כלי פשוט ורב עוצמה להכנת שלפוחיות ענק עם חומרים עטופים.

הכנת ענק שלפוחית ​​encapsulating מיקרוסכמות על ידי צנטריפוגה של אמולסיה מים ב-שמן

אנו מציגים טכניקה עבור המיקרומניפולציה ללא מגע של שלפוחית, באמצעות מעברי צבע יון סידן לשפות אחרות. Microinjection של פתרון יון סידן, באזור שלפוחית השומנים ענק, מנוצל כדי לשפץ ממברנה השומנים, וכתוצאה מכך הייצור של בליטות צינורי ממברנה.

ממברנה שיפוץ של שלפוחית ענקית בתגובה מעברי צבע יון סידן לשפות אחרות

אנו מדגימים תרבות תא יחיד של חיידקים בתוך שלפוחיות ענק (GVs). GVs המכיל תאים חיידקיים הוכנו על ידי שיטת העברת droplet היו מקיבוע על קרום נתמך על מצע זכוכית להתבוננות ישירה של גידול חיידקי. גישה זו עשויה להיות גם הסתגלות לתאים אחרים.

תרבית תאים חיידקיים ברמה תא בודד בתוך שלפוחיות ענק

מטרת הפרוטוקול היא למדוד באופן אמין תכונות מכניות של ממברנה של שלפוחיות ענק על ידי שאיפה מיקרופיפטה.

Obtention של ענק Unilamellar היברידית ושלפוחיות על ידי אלקטרוונטור ומדידה של תכונות מכניות שלהם על ידי שאיפה מיקרופיפטה

מאמר זה מציג שיטה פשוטה לייצור מהיר של שלפוחיות חד-שכבתיות ענקיות עם חלבוני שלד ציטוסקטליים עטופים. השיטה מוכיחה את עצמה כיעילה לשילוב מחדש מלמטה למעלה של מבנים ציטוסקטליים באינטראקציות כליאה וציטוסקלטון-ממברנה.

אנקפסולציה מהירה של שלד ציטוסקי משוחזר בתוך בועיות יונילאמלריות ענקיות

מאמר זה מציג שיטה להכנת שלפוחיות ענק חד-תכליתיות (cGUVs) בעלות מבנה שלפוחית בתוך שלפוחית, עם מוליכות חשמלית מותאמת אישית באזורים פנימיים, טבעתיים וחיצוניים. אלקטרופורמציה מסנתזת GUVs פשוטים, שהופכים לסטומטוציטים ו-cGUVs באמצעות הלם אוסמוטי, ומספקים מודל רב ערך לחקר הביופיזיקה של תאים גרעיניים.

סינתזה של שלפוחיות חד-כיווניות ענקיות: מודל ביומימטי של תאים גרעיניים

מוצג פרוטוקול ניסיוני להרכבה, גירוי חשמלי וניתוח דו-שכבתיות מממשק טיפות עם גרמיצידין A. יחסי מבנה-תפקוד בין ליפידים לחלבון נמדדים על ידי מדידת שינויים בשטח הממברנה, בזרם יוני ובהולכה חד-ערוצית, וקישור תגובות אלו לשינויים דמויי פלסטיות בהולכה יונית במודל ממברנה בהשראת סינפסות חשמליות.

אפיון מבנה תפקוד ממברנת ליפידים-חלבון באמצעות דו-שכבות ממשק טיפות

למדו את שיטת העברת הטיפות להכנת שלפוחיות יונילמלריות ענקיות (GUVs) לביולוגיה סינתטית ומיקרורובוטיקה. פרוטוקול זה מציע יעילות כימוס גבוהה ונגישות למעבדות בסיסיות.

שימוש בשיטת העברת טיפות להכנה אמינה של שלפוחיות יונילמלריות ענקיות

גלה סרטונים נוספים