שימוש בשיטת העברת טיפות להכנה אמינה של שלפוחיות יונילמלריות ענקיות

אנו מכוונים למיקרו-רובוטים דמויי תאים המנווטים דרך רקמות הגוף למתן טיפולים מקומיים. הם מבוססים על שלפוחיות חד-כיווניות ענקיות וממברנה פוספוליפידית ומכילים חלקיקים פעילים. פרוטוקול זה מציע מדריך למתחילים שרוצים לאמץ ולהתאים את שיטת העברת הטיפות בביולוגיה סינתטית ובתחומים אחרים, למשל במיקרו-רובוטיקה.

בהשוואה לטכניקות הכנה אחרות של GUV, פרוטוקול זה מציע יעילות אנקפסולציה גבוהה וביצוע פשוט, מה שהופך אותו לנגיש לכל קבוצת מחקר עם ציוד מעבדה בסיסי. אנו נעריך את הניווט של מיקרו-רובוטים מבוססי GUV בסביבות דמויות רקמה וניישם אסטרטגיות חישה כדי לאפשר תנועה אוטונומית לעבר תאים חולים. כדי להתחיל, הזז את תא הכפפות בתוך מכסה המנוע הכימי או לצדו.

פתח את תא הכפפות והניח מגבש מלא בחלקיקי סיליקה בתחתית החדר. מכסים את המגבש במשטח תמיכה לבן ואז מניחים אותו במגבות נייר. הכנס את כל החומרים הנדרשים לתא הכפפות, והנח את בקבוקון הזכוכית המכיל את תמיסת הכלורופורם על מחזיק טבעת שעם או של 150 מיליליטר הממוקמת קרוב ככל האפשר לצד המפעיל.

כעת, סגור את תא הכפפות, וודא ששני החצאים מיושרים היטב ואינם יכולים להחליק. השתמש בברגי הפלסטיק המסופקים כדי לאטום לחלוטין את החדר. סגור את שסתום היציאה וטבל את צינור מספר חמש בכוס של 500 מיליליטר שמלאה למחצה במים.

לאחר מכן, חבר את קצה הצינור מספר שתיים המווסת על ידי השסתום לקו הוואקום. לאחר מכן, חבר את הקצה השני לקו החנקן באמצעות צינור מספר שלוש. פתח את השסתום והפעל את קו הוואקום עד שהכפפות מתנפחות והופכות נוקשות מכדי להתכופף.

לאחר מכן, סגור גם את קו הוואקום וגם את השסתום. לאחר מכן, פתח את קו החנקן עד שהכפפות מתרוקנות ונמתחות החוצה מתא הכפפות. לאחר לבישת כפפות, השתמש במזרק המילטון כדי להעביר את הנפח שצוין של DOPC בתמיסת כלורופורם לבקבוקון זכוכית כהה.

אטום את הבקבוקון עם הפקק המכיל את המחטים. כעת, חבר את צינור מספר שש לצינור מספר שמונה ואת צינור מספר שבע לצינור מספר תשע באמצעות הצמתים הדו-כיווניים. הסר את הכפפות מתא הכפפות ופתח את שסתום היציאה.

לאחר מכן, פתחו את קו החנקן באיטיות ועקבו אחר זרימת הגז לאיתור בועות בכוס. הגדל בהדרגה את זרימת החנקן עד להגעה לקצב בעבוע קבוע אך נצפה. לאחר שלוש דקות של זרימה, סגור את קו החנקן.

לאחר שהבועה הסופית יוצאת מהכוס, סגור את שסתום היציאה. החזר את הכפפות ונתק את הצינורות שמונה ותשע מהצמתים הדו-כיווניים. לאחר מכן, פתח את הבקבוקון והעבר את הפקק בחזרה לצינור של 50 מיליליטר.

לאחר מכן פתח את בקבוק השמן והעביר את כמות השמן הנדרשת לבקבוקון הכהה. אטמו שוב את הבקבוקון עם המכסה, הסירו את הכפפות ופתחו את תא הכפפות. מערבולת את בקבוקון תרחיף השומנים האטום במרץ למשך 30 שניות לפחות.

לאחר מכן דגרו אותו בחום של 80 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 30 דקות. לאחר מערבולת הבקבוקון שוב, דגרו אותו למשך הלילה בטמפרטורת החדר. בעזרת מספריים, חתכו את הכובע מצינור של חמישה מיליליטר.

קדחו חור של כשמונה מילימטר במרכז המכסה כך שיתאים לקצה פיפטה P1000. אם החור רחב מכדי להתאים לקצה, השליכו את המכסה והפעל מחדש עם חדש. עם רצועת נייר זכוכית בגודל שניים על חמישה סנטימטרים, חלק בשולי החור הקדוח.

הנח את המכסה בחזרה על הצינור של חמישה מיליליטר והצנטריפוגה ב-3,000 גרם למשך חמש דקות כדי לחסל חלקיקי פלסטיק שנותרו. לאחר מכן, הסר את המכסה והשליך את הצינור. כעת, חותכים את הכובע מצינור חדש של חמישה מיליליטר ומחליפים אותו במכסה החורים המוכן.

הכנס קצה P1000 דרך החור עם טבעת O נעולה בין הקצה למכסה כדי למנוע תנועה נוספת כלפי מטה. מלאו את הצינור ב -5.5 מיליליטר תמיסה חיצונית דרך הקצה. מערבולת: בקבוקון השעיית השומנים שהוכן מוקדם יותר למשך 30 שניות לפחות.

לאחר מכן, דגרו אותו באמבט המים של 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. אפשר לתמיסות המים שהוכנו קודם לכן להתייצב בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפחות. כעת, פיפטה 300 מיקרוליטר של תמיסה חיצונית לתוך צינור של 1.5 מיליליטר או צינור של חמישה מיליליטר ששונה בעבר.

שכבה איטית של 100 מיקרוליטר של תרחיף שומנים על גבי תמיסת השמן, מה שמבטיח היווצרות של שני שלבים נפרדים ורציפים. תן לממשק לעמוד ללא הפרעה למשך 10 דקות כדי לאזן. בצינור של שני מיליליטר, פיפטה 250 מיקרוליטר של תרחיף שומנים, ואחריו 6.25 מיקרוליטר של תמיסה פנימית להכנת תחליב מים בשמן.

מערבבים את שני השלבים עד שהאמולסיה נראית הומוגנית ויציבה. העבירו 200 מיקרוליטר של האמולסיה המוכנה לממשק השעיית השומנים של תמיסת השמן שנוצר קודם לכן. אם משתמשים בצינור של 1.5 מיליליטר, פשוט סגור את הצינור.

אם משתמשים בצינור של חמישה מיליליטר ששונה, הניחו מכסה גומי על קצה הפיפטה והעבירו בעדינות את הצינור כולו לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינורות בטמפרטורת החדר במהירות המתאימה. לאחר הצנטריפוגה, ודא שקיימת גלולה אטומה בתחתית וששלב השמן ברור בחלקו העליון.

כדי להסיר שמן מהצינור של חמישה מיליליטר המכיל GUVs, החזר את קצה הפיפטה מהצינור תוך הקפדה על מכסה הגומי נשאר במקומו. השלך את הקצה ושמור את מכסה הגומי, טבעת ה-O ומכסה החזק לשימוש עתידי. במקום זאת, אם אתה משתמש בצינור של 1.5 מיליליטר, השתמש במיקרופיפטה P1000 כדי להסיר את תמיסת השמן, להשאיר מאחור כ-50 מיקרוליטר ולהקפיד לא להפריע לגלולה.

החלף את קצה הפיפטה ולאחר מכן השהה מחדש את הגלולה ב -50 המיקרוליטר הנותרים של התמיסה. לבסוף, העבירו את החומר המרחף לצינור נקי של שני מיליליטר. תמיסות ליפידים שהוכנו בתנאי לחות גבוהה ייצרו שלפוחיות חד-כיוניות ענקיות עם תפוקות נמוכות משמעותית ושכיחות גבוהה יותר של אגרגטים לא מסודרים בהשוואה לאלו שהוכנו בתא מבוקר לחות, אם כי כמה אגרגטים עדיין היו נוכחים באחרון.

ב-3,300 גרם למשך 20 דקות, התפוקה והאיכות של שלפוחיות עמוסות סוכרוז היו אופטימליות, בעוד שמהירויות צנטריפוגה נמוכות וגבוהות יותר אפשרו לתוצאות שליליות, כגון יבול מופחת או היווצרות אגרגטים. שמן מינרלי הביא לשלפוחיות עם פיזור קוטר ממוצע גדול יותר, בעוד ששמן סיליקון AR 20 יצר ספירת שלפוחיות כוללת גבוהה משמעותית.