ניתוח תלת מימד סימולטני של נזק לבבי ותגובה חיסונית באוטם שריר הלב החריף באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור

אנו בוחנים את יחסי הגומלין בין תאים חיסוניים ורקמות פגועות לאחר אוטם שריר הלב. אנו שואפים להבין את התגובה החיסונית ולשפר את תפקוד הלב. הוצע כי לאחר אוטם שריר הלב, כל שלושת הישויות התאיות העיקריות, קרדיומיוציטים ותאים ותאי חיסון צריכים להיות מווסתים על ידי אסטרטגיות מרובות מטרות בו זמנית.

בנוסף לניתוח סימולטני של נזק לבבי ותגובה, יכולנו להראות לוקליזציה תלת מימדית לאזורים הפגועים הללו, שלא הייתה ידועה בעבר. ניתוח תלת מימד, במיוחד בעת ריבוב מטרות שונות, מספק דרך חזקה יותר להעריך את הרכב התאים לאחר אוטם שריר הלב. כדי להתחיל, הנח את העכבר שהומת מתחת למיקרוסקופ סטריאו.

בעזרת מספריים עדינים, פתחו את חלל החזה וחתכו את הווריד הנבוב העליון החשוף קרוב ליציאת הכלי מכלוב הצלעות לצוואר. באמצעות מחט בקוטר 27 המחוברת למשאבת רולר, חדרו את הלב למקומו דרך האורקלים הפרוזדוריים הימניים והשמאליים עם PBS המכיל הפרין. אשר הסרת דם לב מספקת על ידי התבוננות בדהיית הציור השטחי של כלי הדם של הלב והלבנת הריאה והכבד.

כרתו את הלב יחד עם לפחות חמישה מילימטרים של אבי העורקים הנותר ורקמת הריאה שמסביב באמצעות מלקחיים ומספריים, והעבירו אותו לצלחת פטרי בגודל שישה סנטימטרים ממולאת מראש ב-PBS קר כקרח וגזה. כעת, חתכו את רקמת הריאות, השומן וכלי הדם שנותרו עד שיישאר רק הלב עם כחמישה מילימטרים של אבי העורקים. העבירו את הלב לכלי שהוכן לקנולציה של אבי העורקים ומשכו את אבי העורקים הנותר מעל צינורית פלדה קהה בגודל 20.

אבטח אותו לחריץ הצינורית עם תפר יפה של 5-0. העבר את העורק היורד הקדמי השמאלי לצמיתות עם תפר 6-0 במיקום המשמש לאינדוקציה של אוטם שריר הלב החריף החוזר. הזרקו 400 מיקרוליטר של PBS המכילים 20 מיקרוגרם של נוגדן NT CD31 של עכבר, המסומן ב-LexaFluor 546 לאחור דרך הצינורית המוחדרת.

שולפים בזהירות את הצינורית מאבי העורקים ומעבירים את הלב לצינור תגובה מפוליפרופילן בנפח 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של 4% פרפורמלדהיד. דגרו את הצינור למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס בחושך ללא תסיסה. שטפו את הלב הקבוע בשלושה שינויים של חמישה מיליליטר PBS למשך 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר בחושך, תוך שימוש בסיבוב כמעט מעל הראש לתסיסה בתוך צינורות תגובה מפוליפרופילן של חמישה מיליליטר.

יבש את הלב המקובע בחמישה מיליליטר של 50% אתנול במים נטולי יונים למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר בחושך, תוך התסיסה עם סיבוב כמעט מעל הראש בצינורות תגובה של חמישה מיליליטר. כדי להלבין את הלב המיובש, העבירו אותו לצינור תגובה של 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של 100% אתנול עם 5% דימתיל סולפוקסיד ו-5% מי חמצן, ודגרו אותו בארבע מעלות צלזיוס בחושך למשך ארבע שעות ללא תסיסה. שטפו את הלב המולבן בחמישה מיליליטר של 100% אתנול שלוש פעמים במשך 12 שעות כל אחת בטמפרטורת החדר בחושך, תוך שימוש בסיבוב כמעט מעל הראש לתסיסה בצינורות תגובה של חמישה מיליליטר.

העבירו את הלב לצינור תגובה של חמישה מיליליטר המכיל ארבעה מיליליטר של אתיל צינמט ודגרו אותו ללא תסיסה במשך שלושה ימים בטמפרטורת החדר בחושך. חותכים ג'ל נקי וגושי חניכיים לגודל המייצב את הלב הנקי במחזיק דגימת המיקרוסקופ. השתמש בעדשת אובייקט עם צמצם מספרי 0.1 עם מרחק עבודה של 17.6 מילימטרים לרכישת תמונה.

לאחר מכן זהה את אותות הקרינה באמצעות הגדרות מסנן עירור ופליטה מתאימות. להדמיית מיקרוסקופיה של גיליון קל, בחר צמצם מספרי של גיליון של 0.079, וכתוצאה מכך עובי גיליון קל של חמישה מיקרומטרים. הגדר את המרחק בין שני מישורי Z בודדים ל-10 מיקרומטר.

השתמש ברוחב גיליון של 100% כדי להשיג תאורה הומוגנית של הדגימה. פרוסות הלב המייצגות את האזור בסיכון, פגיעה באנדותל ונויטרופילים שחדרו באמצעות צביעת נוגדנים רב-ערוצית ואוטופלואורסצנציה מומחשות באיור זה. האזור בסיכון זוהה על ידי היעדר צביעת CD31 לאחר הזרקה לאחור, פגיעה באנדותל על ידי שליליות CD31 תוך ורידית וחדירת נויטרופילים על ידי נקודות חיוביות ל-Ly6G, בעיקר ליד אזורי פציעה.

הדמיות תלת מימד הראו חפיפה בין AAR, פגיעה אנדותל ואשכולות נויטרופילים, מה שמרמז על לוקליזציה חיסונית ספציפית לאזור. הכימות הראה 90.2% מהנויטרופילים ב-AAR לעומת 9.8% באזורים מרוחקים, מה שמעיד על דלקת מקומית. בתוך AAR, 79.3% מהנויטרופילים היו מחוץ לנפח הפגיעה האנדותלית ו-20.7% בפנים, מה שמרמז על התקבצות היקפית סביב נזק.