בידוד, תרבית ואפיון של פיברובלסטים הקשורים לסרטן הערמונית

אנו שואפים להבין את המנגנון שבאמצעותו פיברובלסטים הקשורים לסרטן תורמים להתקדמות הגידול בסרטן הערמונית במטרה לנטרל את הדיבור ההדדי הזה כאסטרטגיה טיפולית. ניתן להעריך אוכלוסיות מובחנות של CAFs בעלות תכונות שונות באורגנואידים תלת מימדיים המתקבלים באמצעות תאי גידול ותאי סטרומה במניפולציות שונות. הפרוטוקול שלנו מאפשר ליצור CAF באופן אמין למטרות אלה.

האתגרים העיקריים הם בידוד אמין של גידול ותאים נורמליים מאותן סביבות של חולים, הטרוגניות, היעדר סמני CAF ספציפיים, הפלסטיות של CAFs ומודלים מוגבלים במבחנה המסכמים את מורכבות TME. בשיטות דומות, אפיינו את התפקיד הבסיסי של גורם השעתוק STAT3 וגני המטרה שלו ב-CAFs של סרטן השד בעכברים, והדגמנו את יעילותם כמטרות טיפוליות. בידוד אופטימלי של פיברובלסטים מהגידול ומהאזורים הנורמליים הסמוכים של דגימות כריתה רדיקליות של הערמונית המתקבלות מחולי סרטן הערמונית תוך שימוש בכמות קטנה של הרקמה.

כדי להתחיל, שקלו את דגימות הרקמה על המאזן ביום הראשון לבידוד פיברובלסטים. בעזרת מלקחיים סטריליים מעבירים את הרקמה לכלים של שישה סנטימטרים. שטפו את הרקמה פעמיים בארבעה מיליליטר PBS קר כקרח ופעמיים בארבעה מיליליטר DMEM מלא קר כקרח.

כעת, העבירו את הרקמה לצלחת של שישה סנטימטרים על קרח. הוסף לצלחת מיליליטר אחד של DMEM בתוספת אנטיביוטיקה. לאחר מכן השתמש במספריים או בלהבים כדי לטחון את הרקמה לשברים קטנים ממילימטר מרובע אחד.

העבירו את הרקמה הטחונה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר DMEM שלם קר כקרח. לאחר מכן צנטריפוגה את המתלה ב 754 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. בעזרת פיפטה של 10 מיליליטר, הסר את הסופרנטנט.

השעו מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר קרח קר השלימו DMEM וצנטריפוגה שוב. לאחר הסרת הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה בתמיסת קולגנאז II. העבירו את המתלה למיקרו-צינורות של 1.5 מיליליטר.

אטום את המיקרו-צינורות בסרט פרפין. לאחר מכן הניחו אותם על 37 מעלות צלזיוס לעיכול לילה עם נדנוד מתמשך במשך שמונה עד 12 שעות. למחרת, העבירו את הדגימות המעוכלות לצינורות חרוטיים של 15 מיליליטר.

פיפטה חמישה מיליליטר קר כקרח השלים DMEM כדי לנטרל קולגנאז. לאחר מכן צנטריפוגה את המתלה ב 754 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. יש להשעות את הגלולה במיליליטר אחד של 0.05% טריפסין-EDTA לאחר הוצאת הסופרנטנט.

דגירה במשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול מדי פעם. לאחר מכן, פיפטה מיליליטר אחד של תמיסת DNase I שהוכנה טרייה לדגימות וערבב היטב. לאחר צנטריפוגה והסרת הסופרנטנט, השעו מחדש את הכדור בחמישה מיליליטר של DMEM וצנטריפוגה מלאים קרים שוב.

השעו מחדש את התאים המתקבלים ב-DMEM מלא בתוספת סרום בקר עוברי של 20%. צלחת התאים ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ו-95% לחות למשך שלושה ימים לפחות. לאחר שלושה ימים, בדוק את התאים למורפולוגיה וכדאיות.

ברגע שהתאים מגיעים למפגש, העבירו אותם לצלחת של 10 סנטימטר המכילה DMEM מלא עם סרום בקר עוברי של 20%. פיברובלסטים הקשורים לסרטן הצלחת או פיברובלסטים רגילים במפגש של 70% ב-12 צלחות באר. למחרת, הוסף 0.45 גרם אגר נקודת התכה נמוכה ל-12.5 מיליליטר PBS בצינור חרוטי של 50 מיליליטר בתנאים סטריליים.

ממיסים את התערובת בעזרת מיקרוגל. מצננים את תמיסת האגר עד 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן יש לדלל ביחס של אחד לארבעה עם DMEM שלם שחומם מראש כדי להכין פיתרון עובד.

שואבים את המדיום מצלחת 12 הבאר. פיפטה 500 מיקרוליטר מתמיסת האגר העובדת לכל באר. דגירה במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לאפשר התמצקות אגר.

בינתיים, שמור את תמיסת האגר הנותרת על 37 מעלות צלזיוס. נסה את תאי הגידול והכין תרחיף תאים של 20,000 תאים למיליליטר. מערבבים נפחים שווים של תרחיף תאי הגידול ותמיסת האגר כדי לקבל נפח סופי של שבעה מיליליטר, המהווים שלושה שכפולים טכניים לכל מצב.

פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להבטיח ערבוב אחיד. לאחר מכן הוציאו 500 מיקרוליטר מתערובת זו המכילה כ-5,000 תאים על גבי שכבת הבסיס המוצקה בכל באר. לאחר שנתנו לאגר להתמצק במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, הוסיפו מיליליטר אחד של DMEM שלם לכל באר.

החלף את המדיום כל יומיים על ידי שאיבה עדינה מקצה הבאר והוספת מדיום טרי למרכז. דגירה עד שהמושבות נראות בקלות. ברגע שהמושבות נראות לעין, השליכו את המדיום התרבותי.

לאחר מכן צבעו את המושבות ב -200 מיקרוליטר של תמיסת טטרזוליום כלוריד כחולה ניטרו. דגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח. למחרת, השליכו את תמיסת הצביעה.

רכוש תמונות של מושבות מוכתמות באמצעות מיקרוסקופ סטריאו. פיברובלסטים טהורים בודדו בהצלחה. במקרים רבים, במיוחד במעברים מוקדמים, פיברובלסטים הקשורים לסרטן הראו מורפולוגיה דמוית ציר יותר בהשוואה לפיברובלסטים רגילים.

ניתוח כמותי אישר כי התפשטות תאי DU145 שטופלו במדיה מותנית פיברובלסטים הקשורה לסרטן הייתה גבוהה משמעותית במשך 120 שעות מאלה שטופלו במדיה מותנית פיברובלסטים רגילה או שלא טופלו. תאי DU145 שגודלו ישירות עם פיברובלסטים הקשורים לסרטן ופיברובלסטים רגילים הראו גם התפשטות מוגברת במשך 96 שעות ביחס לביקורת. עקומות גדילה תואמות הראו כי תרבית משותפת עם פיברובלסטים הקשורים לסרטן ונורמליים הביאה לעלייה דומה בהתפשטות DU145 לאורך זמן.

ההשפעה של מדיה מותנית על התפשטות DU145 השתנתה בין זוגות פיברובלסטים הקשורים לסרטן ופיברובלסטים רגילים עם זוגות מעבר מוקדמים שהראו השפעות חזקות משמעותית מאשר מאוחרים יותר. במבחני היווצרות מושבות אגר רכות, פיברובלסטים הקשורים לסרטן וגם פיברובלסטים רגילים הגדילו את המספר והגודל של מושבות DU145 בהשוואה לביקורת, מה שמעיד על צמיחה בלתי תלויה בעיגון משופר. שכבות פיברובלסטים מנותקות שנוצרו עקב בעיות טכניות מנעו היווצרות מושבה בחלק מהשכפולים.

מדיה מותנית לבדה לא קידמה היווצרות מושבה בלתי תלויה בעיגון בתאי DU145.