ריצוף Amplicon באמצעות טכנולוגיות ריצוף לקריאה ארוכה

אני בודק האם ריצוף נייד לטווח ארוך יכול לספק תוצאות רגישות לתרופות לשחפת בסביבות מוגבלות משאבים עם דיוק הדומה לשיטת תקני זהב, תוך קידום אבחון איכותי ונגיש של שחפת. שימוש בריצוף ממוקד מהדור הבא ככלי אבחון לשחפת עמידה לתרופות, על ידי הצעת פרופיל עמידות מקיף ישירות מדגימה קלינית ללא מומחיות בביואינפורמטיקה. הפרוטוקול שלנו המשתמש בריצוף קריאה ארוכה יכול לספק זמני תגובה מהירים יותר, זרימת עבודה פשוטה יותר מאשר בזיהוי התנגדות בזמן אמת, להקל על אבחון מקיף של שחפת ולשפר את מעקב ההתפרצויות בסביבה מוגבלת משאבים עם תשתית מינימלית.

כדי להתחיל, חשב 100 ננוגרם מכל דגימת אמפליקון לפי הריכוז והעבר את הנפח הנדרש לצינור PCR נקי. כדי לקבוע את המסה הכוללת של המאמפליקונים בדגימה, השתמשו בנוסחה הניתנת. כוונו את הנפח הכולל של כל דגימה ל-12.5 מיקרוליטר באמצעות מים ללא נוקלאז.

ערבבו את הדגימות בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים וסובבו אותן בקצרה במיקרוצנטריפוגה. לאחר מכן, הוסף 1.75 מיקרוליטר של בופר תגובת תיקון קצה ואדנילציה לכל דגימה, ואחריהם 0.75 מיקרוליטר של תערובת אנזימי תיקון קצה ואדנילציה. לאחר ערבוב וסיבוב הדגימות, הניחו את הצינורות בתרמחזור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ואחר כך 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

לקישור ברקוד טבעי, הוסף את הרכיבים שמוצגים על המסך בצינורות PCR חדשים. מערבבים את התגובות בעדינות על ידי פיפטינג וסובבו בקצרה באמצעות מיקרוצנטריפוגה. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של EDTA לכל שפופרת.

לאחר מכן, ערבב היטב וסובב בקצרה כפי שהוצג קודם. למשוך את הדגימות עם ברקוד לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר. סחרר את חרוזי ניקוי ה-DNA כדי להחזיר אותם לתלייה מלאה והוסף נפח השווה ל-0.7 פעמים נפח הדגימה המאוחד.

ערבבו את תמיסת דגימת החרוזים ודוגרו אותה על HulaMixer בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, להכנת שני מיליליטרים של 80% אתנול, ערבבו 1,600 מיקרוליטר של אתנול טהור עם 400 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז. הנח את הצינור על מתקן מגנטי למשך חמש דקות עד שהאלואט נראה צלול וחסר צבע.

לאחר מכן, הסר והשליך את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. שטפו את החרוזים עם 700 מיקרוליטר של 80% אתנול טרי והוכן בצנטריפוגה קצרה. לאחר הנחת הצינור על מתקן המגנטי, הסר את שאריות האתנול.

עכשיו, הסר את הצינור מהמתקן המגנטי. החזירו את החרוזים ב-35 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז על ידי ניעור עדין ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. החזיר את הצינור למתקן המגנטי עד שהאלואט הופך לברור וחסר צבע.

לאחר מכן, העבר 35 מיקרוליטר של האלואט לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי בנפח 1.5 מיליליטר לשימוש נוסף. לקשירת מתאם, ערבב את הרכיבים הניתנים בצינור מיקרוצנטריפוגה נמוך בנפח 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור לזמן קצר ודוגר בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.

תפעיל את חרוזי ניקוי ה-DNA כדי להחזיר אותם לתלייה מלאה. הוסיפו 20 מיקרוליטר של חרוזים לצינור וערבבו בעדינות. דגרו על HulaMixer במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, מניחים את הצינור על מתקן מגנטי כדי לפלט את החרוזים ולשאוף את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. הוסיפו 125 מיקרוליטר של בופר קטע קצר ונענעו בעדינות את הצינור כדי להחזיר את החרוזים. צנטריפוגה לזמן קצר והחזיר את הצינור למתקן המגנטי.

שאף שוב את הסופרנטנט לאחר שהחרוזים נזרקו. כעת, הסר את הצינור מהמתקן המגנטי ותלה מחדש את החרוזים ב-15 מיקרוליטר של בופר שחרור על ידי פיפטינג עדין או פליקינג. צנטריפוגה קצרה של הצינור כדי לאסוף את התכולה, ואז דגרו אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להוציא את ה-DNA.

הניחו את הצינור על מתקן מגנטי עד שהאלואט נקי וחסר צבע. לאחר מכן, שואף 15 מיקרוליטר של אלואט והעבר אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי בנפח 1.5 מיליליטר. להכנת תמיסת פריימינג של תאי הזרימה, ערבבו היטב את הרכיבים הניתנים.

פתח את פתח הפריימר של תא הזרימה, שאפו כ-20 מיקרוליטר של בופר להסרת בועות אוויר, וטעון 800 מיקרוליטר מתערובת הפריימר לתוך הפתח מבלי להכניס בועות אוויר. כדי להכין את ספריית ה-DNA, ערבבו היטב את הרכיבים שמוצגים על המסך. הרם בעדינות את מכסה פורט הדגימה של תא הזרימה, טען 200 מיקרוליטר של תערובת פריימינג לתוך פתח הפריימר מבלי להכניס בועות אוויר.

לאחר ערבוב ספריית ה-DNA המוכנה, טען 75 מיקרוליטר מהספרייה בנקודת הנפילה לתוך פורט דגימות תאי זרימת הרצף. סגור את מכסה פורט הדגימה של תא הזרימה, וודא שהבאנג נכנס היטב ליציאת הדגימה, ואז סגור את פתח הפריימר בחוזקה. אלקטרופורזה ג'לית אישרה שלמות אמפליקון כמעט בכל הדגימות, אך נתיבים תואמים לדגימות 89 ו-136 הראו פסים חלשים או חסרים.

דגימות 89 ו-136 הכילו ריכוזי אמפליקון לא מספקים, מה שהוביל להוצאתן מריצוף קריאה ארוכה. בכל הגנים הממוקדים, פלטפורמות הקריאה הארוכה והקצרה השיגו עומקי כיסוי גבוהים, כאשר גן EIS הציג את הערכים הממוצעים הגבוהים ביותר וגן RRS הציג את עומקי הכיסוי הנמוכים ביותר. למרות טווח עומק הכיסוי, שתי הפלטפורמות שמרו על רוחב כיסוי גבוה של 99.9% בכל הגנים הקשורים לעמידות.

זוהו וריאנטים של עמידות לתרופות לאת'מבוטול, פלואורוקווינולונים, קאנמיצין, אמיקאסין וקפראומיצין עם התאמה מלאה בפלטפורמות ריצוף קצר וארוך. לא נמצאו מוטציות הקשורות לעמידות עבור לינזוליד, בדקווילין וקלופאזימין באמצעות אף אחת מגישות הריצוף. זיהוי התנגדות לסטרפטומיצין הראה התאמה נמוכה יותר בין הפלטפורמות, עם הסכמה של 71.43% בלבד.

רגישות הזיהוי של גנים מרכזיים rpoB, katG/fabG1/ahpC/inhA, fabG1/inhA ו-pncA נעה בין 89.47% ל-96.77% בין הפלטפורמות.