מיקרוסקופ אלקטרונים שידור כטכניקת הדמיה לניתוח הפלסטיות הסינפטית הצירקדית בקליפת המוח של חבית העכבר

אנו מתעניינים בפלסטיות עצבית, במיוחד בשינויים צירקדיים בפלסטיות של סינפסות, נוירונים ותאי גליה. אנו מנסים לענות על השאלה כיצד סינפסות משתנות במהלך היום והלילה ובתנאים פתולוגיים. ההתפתחויות האחרונות בתחום המחקר שלנו הן שימוש בכלים גנטיים שונים כדי לתמרן את ביטוי הגנים, כמו גם שימוש בשיטות להמחשת שינויים במוח, כמו גם מספר הולך וגדל של מודלים של בעלי חיים לחקר מחלות נוירודגנרטיביות. גילינו, באמצעות מיקרוסקופ העברת אלקטרונים, שמספר הסינפסות בקליפת המוח החבית של עכברים משתנה במהלך היום והלילה. והמקצב הזה הוא גם צירקדי, לפחות במקרה של סינפסות מעכבות. מכיוון שסינפסות מעכבות, הן גדלות במספרן במהלך הלילה, בעוד שסינפסות מעוררות גדלות במהלך היום. שינויים דומים מצאנו במוחו של זבוב הפירות. במין זה, גם מספר הסינפסות משתנה במהלך היום והלילה. ובנוסף, מצאנו שינויים מבניים בצורת תאי העצב ותאי הגליה.

[קריין] כדי להתחיל, קחו את המוח הקטן של העכבר וחלקו את המוח לשתי המיספרות. בחר חצי כדור אחד וכוון אותו כך שניתן יהיה לחתוך חלקים באופן משיקי לקליפת החבית. לאחר מכן, חותכים את החלקים בעובי של 60 מיקרומטר, ומעבירים אותם לתמיסה המכילה מאגר פוספט 0.1 מולרי ומקבע ביחס של אחד לחמש. בחנו את החלקים תחת מיקרוסקופ אור, ואספו רק את החלקים שמראים בבירור את קליפת השדה של החבית. בעזרת מברשת מעבירים בעדינות את החלקים לצלחת פטרי זכוכית קטנה. שוטפים את חלקי המוח בקקודילאט 0.1 מולארי. לאחר מכן, תקן את החלקים ב-1% אוסמיום טטרוקסיד במאגר קקודילאט 0.1 מולרי עם 1.5% אשלגן פריציאניד. לאחר שטיפת החלקים במים מזוקקים, השתמש במזרק עם פילטר 25 מילימטר כדי להוציא לאט 70% אתנול המכיל 1% אורניל אצטט לכל צלחת פטרי עם טישו. לאחר דגירה של לילה ב-70% אתנול בארבע מעלות צלזיוס, יש לשטוף טישו ב-80%, 90% ו-100% אתנול. לאחר מכן, שטפו את הטישו פעמיים בתחמוצת פרופילן למשך 10 דקות כל אחת. לאחר מכן, החלף את תחמוצת הפרופילן בשני מיליליטר של תערובת אחד לאחד של שרף פולי/מיטה ותחמוצת פרופילן. מכסים במכסה ודוגרים למשך 40 דקות. הטמיעו את חלקי המוח בשני מיליליטר של תערובת של שלושה לאחד של שרף פולי/מיטה ותחמוצת פרופילן. מכסים ומשאירים למשך 1.5 שעות. לאחר מכן, חותכים את סרט ה-ACLAR לחתיכות התואמות את הגודל של שקופית זכוכית רגילה. בעזרת פיפטה מפלסטיק, מרחו נפח קטן של שרף על כל חתיכת סרט ACLAR. בעזרת מכחול, העבירו את חלקי המוח מצלחת הפטרי לשרף בסרט ACLAR. הטמע כל קטע בין שני סרטי ACLAR, ודגירה לפילמור. באמצעות מיקרוסקופ אור עם מטרה כפולה, צלם את חלקי המוח המוטמעים. לפתיחת התמונות, לחצו על File and Open, בחרו בתמונות תוך כדי לחיצה ממושכת על Shift ולחצו על Open. התחל לערום תמונות מקליפת המוח. לחץ לחיצה ימנית על שכבה 1 בכל תמונה, בחר שכפל שכבה והזן את מספר התמונה כשם בתיבת הדו-שיח. בחרו תמונה אחת כקובץ היעד ולחצו על הלחצן 'אשר'. לאחר מכן, השתמשו בכלי Move כדי ליישר את התמונות באופן ידני, והתאימו את הכיוון באמצעות Edit, Transform, Rotate או Flip בהתאם לצורך. להתאמות עדינות יותר, השתמשו בפקודות 'עריכה', 'שינוי צורה', 'עיוות' והזיזו את הפינות בנפרד כדי להתאים לנקודות ציון אנטומיות. קבעו את מצב המיזוג של השכבה העליונה לכיסוי בחלונית Layers כדי להקל על היישור. בכל חלק המציג את קליפת החבית, השתמש במיקרוסקופ סטריאו כדי לזהות את הקנה שנבחר, וחתוך אותו יחד עם הקנה הסמוך באמצעות סכין גילוח. לאחר הטמעת הקטע בבלוק שרף, אסוף את החלקים הדקים במיוחד על רשתות ניקל בעלות חריץ יחיד מצופה Formvar. לאחר יישור ערימת תמונות TEM כפי שהודגם קודם לכן, הגדר את אזור הניתוח. לחץ על Layer ולאחר מכן על New and Layer, ולאחר מכן לחץ על OK. בחר את הכלי Rectangle, עבור אל Layer, Layer Style, Stroke. הגדר את הצבע, העובי והמיקום של הקו לפנים ולאחר מכן לחץ על אישור. כעת, צייר מלבן כדי להגדיר את גבול הניתוח ובחר מלא 0%. כדי להוסיף שכבה חדשה לביאורים, בחר Layer, New, Layer ולאחר מכן לחץ על OK. השתמש בכלי Brush כדי לסמן סינפסות בשכבה זו. השתמשו בכלי Zoom ובכלי Hand כדי להבטיח דיוק בשעת הוספת הערות. כעת, פתחו את ערימת התמונות המיועדת לשחזור תלת-ממדי. בחר בכלי חיתוך, סמן את האזור הכולל את השידרה הדנדריטית לאורך האוסף, והקש Enter כדי לחתוך אזור זה בכל השכבות הגלויות. כדי להפוך שכבה אחת בלבד לגלויה בכל פעם, החליפו את סמל העין בחלונית Layers. לחצו על 'קובץ', 'שמור בשם', תנו שם לקובץ, בחרו בתבנית JPG ולחצו על 'אשר' לשמירת כל תמונה שנחתכה בנפרד. פתח את תוכנת השחזור התלת-ממדית. לפני ההעלאה, לחץ על Z בגיזמו הניווט או הקש בלוח המספרים 7 כדי ליישר את הפרספקטיבה של אזור התצוגה. לאחר מכן, כדי להעלות את התמונות, לחץ על הוסף, תמונה, הפניה, ולאחר מכן בחר את התמונה הראשונה ולחץ פעמיים כדי לאשר. כדי למקם את תמונת ה-TEM הסופית לאורך ציר ה-z, לחץ על התמונה. בחלונית Object Properties בסרגל הצד הימני, הזן את הערך המתאים בשדה Location Z. לפיזור שווה של כל התמונות לאורך ציר z, בחרו בכל האובייקטים בתמונה. לחץ על End כדי לפתוח את החלונית End. נווט אל הכרטיסיה עריכה ולחץ על הפץ Z כדי לרווח אותם באופן אוטומטי בהתבסס על עובי המקטע. כדי לשרטט ידנית את צורת השידרה הדנדריטית בכל תמונת TEM באמצעות עקומה אחת לכל תמונה, לחצו על 'הוסף', 'עקומה' ו'עיגול'. כדי להזיז את העיגול, החזק את g, גרור את העכבר ולאחר מכן לחץ כדי לאשר את המיקום. החזק את s כדי להתאים את הגודל ולאחר מכן לחץ כדי לאשר. לאחר מכן, שנה את קנה המידה של האובייקט כך שיתיישר עם צורת עמוד השדרה הדנדריטי. כעת, שנה את הצורה המעוקלת כך שתתאים לגבול השידרה. בחרו נקודת בקרה, הקישו g, הזיזו את הנקודה ולחצו לאישור. השתמש במקשי g או s לפי הצורך כדי לכוונן את נקודות האחיזה, ולחדד את הכיוון והעוצמה של העקומה. כדי להוסיף פרטים נוספים, החזק את מקש Shift ובחר שתי נקודות בקרה סמוכות. לאחר מכן לחץ לחיצה ימנית ובחר Subdivide כדי להוסיף נקודה חדשה ביניהם. לאחר שהעקומה מתארת במדויק את השידרה, היכנסו לכרטיסייה Layout, לחצו לחיצה ימנית על אובייקט העיגול Bezier ובחרו Duplicate Object מבלי להזיז את העכבר. כדי לחבר את הקצוות של האובייקט המצורף וליצור רשת שינוי סגורה, היכנסו לכרטיסייה Modeling. לחץ על 2 כדי לעבור למצב בחירת קצה. לחצו על 'בחר', 'הכל', לחצו לחיצה ימנית ובחרו Bridge Edge Loops כדי לקשר את טבעות הקצוות. למילוי הרווח בראש האובייקט, בטל את הבחירה באפשרות All בלחיצה לידו. החזק את Alt ולחץ על קצה אחד של המדף העליון כדי לבחור את הלולאה כולה. לחץ לחיצה ימנית ובחר Extrude Edges, גרור כלפי מעלה לאורך ציר z. כעת, לחץ על s, הזז את העכבר פנימה כדי לכווץ את הלולאה החדשה ולחץ כדי לאשר. כשהלולאה עדיין נבחרת, לחצו לחיצה ימנית ובחרו 'פנים חדשות מהקצוות'. כדי להחליק את המבנה הסופי, עבור אל הכרטיסייה Modifiers בסרגל הצד הימני. לחץ על הוסף צירוף, נווט אל צור ובחר משטח חלוקת משנה. הגדר את אזור התצוגה ואת רמות הרינדור ל-1 להחלקה עקבית. להקצאת צבע למבנים בודדים, בחר באובייקט הרצוי. פתח את הכרטיסייה חומר בסרגל הצד הימני, לחץ על חדש והגדר את צבע הבסיס. בחרו בעצם האור להתאמת תאורת הסצנה. לחץ והחזק את g, הזז את העכבר כדי למקם מחדש את האור ולחץ כדי לאשר את מיקומו החדש. כדי למקם את המצלמה לרינדור, כוונו את אזור התצוגה כך שיפנה לעמוד השדרה הדנדריטי כפי שהוא אמור להופיע בפלט הסופי. הקש Control + Alt + 0 בלוח המספרים כדי להצמיד את המצלמה לתצוגה הנוכחית. התאם את מסגרת המצלמה על ידי בחירתה, לחיצה ממושכת על g והזזתה כדי לחדד את המסגור. ניתן היה לזהות את קליפת המוח הסומטוסנסורית של העכבר אפילו בחלקי מוח לא מוכתמים, וניתן היה לשחזר את כל שדה הקנה באמצעות כלים דיגיטליים למרות התפלגות החביות הבודדות על פני מספר חלקים. תמונות TEM עוקבות דקות במיוחד אפשרו סיווג אמין של סינפסות לסוגים מעוררים או מעכבים על סמך ראיות חזותיות סדרתיות. שחזור תלת מימדי של קוצים דנדריטיים מקטעים סדרתיים איפשר הדמיה של מורפולוגיה של עמוד השדרה, וחשף צורות שונות, כגון קוצים דקים, פטרייתיים, זעירים ובינוניים. צורות עמוד השדרה כומתו על סמך מדידות, כולל אורך עמוד השדרה, אורך הצוואר וקוטר עמוד השדרה, הראש והצוואר.